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甲醛固定的免疫荧光实验步骤

重要事项:本实验步骤对未标记和荧光标记的抗体均适用。请参阅产品网页或产品数据表上的产品使用信息部分,以确定该产品是否已通过验证并批准用于培养细胞系(IF-IC)或冷冻组织切片(IF-F) 。

:某些 CST™ 抗体使用备选实验步骤时效果最佳。请参见产品网页上的实验步骤,了解针对特定产品的建议。

A. 溶液和试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片,请使用我们的 Immunofluorescence Application Solutions Kit (#12727) 中高效且划算的预制试剂。

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  • 1X Phosphate Buffered Saline (PBS): 要配制 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH2O 中,混匀。调节 pH 至 8.0。
  • 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746):使用新鲜溶液。
  • 封闭缓冲液:购买即用型免疫荧光封闭液 (#12411),或通过添加来自与二抗相同物种的 0.5 ml 正常血清(例如,正常山羊血清 (#5425) )和 30 µL Triton ™ X-100 到 9.5 mL 1X PBS中来制备 1X PBS /5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100 缓冲液。储存在 4°C。
  • 抗体稀释缓冲液: 购买即用型免疫荧光抗体稀释缓冲液 (#12378),或通过添加可 0.1 g BSA(#9998)和 30 µl Triton ™ X-100 至 10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100 缓冲液。储存在 4°C。
  • 荧光素偶联的二抗: 使用对您的一抗宿主物种(例如兔子)具有反应性的二抗。单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。

B. 固定

:所有后续孵育都应在室温(20-25°C)下进行, 除非另有说明。

  1. 对固定的冷冻组织(IF-F)进行免疫染色(C 部分)。
  2. 对于培养的细胞系(IF-IC)或未固定的冷冻组织切片(IF-F),请立即固定,如下所示:
    1. 用 4% 的甲醛将样品覆盖到 2–3 mm 的深度。
    2. 让标本在室温下固定 15 分钟。
    3. 用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时,在抗体稀释缓冲液中制备一抗(建议的稀释范围请参见产品网站)。
  3. 吸出封闭溶液,然后加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 温度下孵育过夜
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。

:如果使用荧光物质标记的一抗,则跳转到 C部分,第 8 步。

  1. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后,避光孵育标本 1–2 小时。
  2. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟,使其避光。
  3. 适当的复染。

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括 DNA 染料等)时,请参考染料产品页,以了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。

  1. 安装样品进行成像。
  2. 为了长期保存,请在 4°C 下避光保存样品。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2021 年 1 月

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