CUT&Tag 试剂盒实验步骤

CUT&Tag 实验步骤

! ! 表示实验步骤中 需要根据进行的 CUT&Tag 反应次数来调整体积的重要步骤。

!! !! 表示需要在操作前 稀释缓冲液的一个重要步骤。

安全停止 如果需要停止， 这是实验步骤中的一个安全停止点。

一、Concanavalin A 珠子的激活

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 将 Concanavalin A Bead Activation Buffer 放在冰上。
• 确定要进行的 CUT&Tag 反应次数。我们强烈建议包含针对 阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 的反应。阴性对照，即 Normal Rabbit IgG #2729 或 Normal Mouse IgG #68860，可根据峰识别算法的要求 选择是否使用。

1. 通过轻轻上下吹打小心地将 Concanavalin A 磁珠重悬到均匀的混悬液中， 确保不要将任何磁珠悬液溅出试管。

   注：在整个实验步骤中避免将 Concanavalin A 磁珠悬液涡旋， 因为反复涡旋可能会使 Concanavalin A 从珠子中移位。

2. 按照每个 CUT&Tag 反应，将 10 µL 珠子悬浮液转移到一个新的 1.5 mL 微量离心管中。如果 计划一次进行 14 次以上的 CUT&Tag 反应，请使用两个或更多个 1.5 mL 微量离心管 。每 1.5 mL 微量离心管中应加入不超过 140 µL 的 Concanavalin A 珠子。
3. 每 10 µL 珠子添加 100 µL Concanavalin A 珠子激活缓冲液。上下吹打来轻轻混合珠子 。
4. 将试管置于磁力架上 30 秒至 2 分钟，然后使用移液管丢弃上清液。

   注：为避免丢失珠子，在整个实验步骤中请勿使用真空来抽吸。

5. 从磁力架上取下试管。重复步骤 4 和 5 来洗涤珠子。
6. 添加与最初添加的珠子悬液体积相等的 Concanavalin A 珠子激活缓冲液 （每反应 10 µL），并通过上下吹打重悬。

   注：活化的珠子可在冰上储存长达 8 小时。

二、细胞和组织制备

对于大多数细胞类型，活细胞可用于 CUT&Tag 检测，以产生强大的组蛋白、 转录因子和辅因子富集。我们强烈建议尽可能使用活细胞。对于某些脆弱或对 Concanavalin A 敏感的细胞类型， 在进行 CUT&Tag 之前，请参阅附录 A，以了解略微固定细胞的实验步骤 。请注意，细胞固定不会增加 CUT&Tag 信号， 过度固定可能对酶切法片段化反应有害。

新鲜组织也可用于 CUT&Tag 检测，以产生稳定的组蛋白富集。然而， 转录因子和辅因子等非组蛋白靶点在 CUT&Tag 检测中的富集效果不佳。对于 分析组织中的转录因子和辅因子，我们建议使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。新鲜组织通常生成与固定组织相当或更强的 CUT&Tag 信号。如果需要固定，在进行 CUT&Tag 实验前，请参考附录 B， 以了解略微固定组织的实验步骤。

我们的 CUT&Tag 检测适用于各种不同的细胞和组织类型以及各种起始材料量 。我们建议每反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织。如果起始细胞数量有限， 则组蛋白修饰靶标每次反应可能只需要 5,000 到 10,000 个细胞， 转录因子和辅因子每次反应可能需要 20,000 个细胞。低输入量反应的成功与否 取决于靶标丰度和抗体敏感性。足够量的起始材料对于所需的 CUT&Tag 信号至关重要，特别是对于转录因子和辅因子。每次反应最多可使用 250,000 个细胞或 5 mg 组织。一次反应中使用的整个实验步骤的缓冲液体积不需要 根据细胞数量或组织质量进行调整，只要这些值落在指定范围内（5,000-250,000 个细胞或 1-5 mg 组织）即可。当有说明时，所有缓冲液的体积需要根据正在进行的反应次数按比例调整 。

A. 活细胞制备

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 使用前彻底解冻 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 和 100X Spermidine #27287，并且在当天用毕后置于 -20°C 下储存。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 制备完全洗涤缓冲液（为每份细胞制备物制备 2 mL，为每个 CUT&Tag 反应额外制备 100 µL）并保存于室温。例如，如果同时使用未经处理的细胞和经药物处理的细胞（2 份细胞制备物）并用 4 种抗体检测（阳性对照 H3K4me3 #9751、阴性对照 IgG #2729 或 #68860，以及两种实验性抗体；8 次反应），则需要总共 4.8 mL 完全洗涤缓冲液。

注：活细胞制备的所有步骤应在室温下连续进行， 以最大程度减少细胞压力。请勿涡旋搅拌细胞样品，避免 DNA 片段化和细胞空化。

1. 在室温下针对每次反应收集 100,000 个活细胞，以尽量减少对细胞的压力。

   注：对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来，并用至少 3 倍体积的组织培养基中和。我们不建议从培养皿刮取细胞， 以防细胞裂解。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器准确计数细胞， 以确保实验中使用精确数量的细胞。

2. 在室温下将细胞悬液以 600 × g 的离心力离心 3 分钟，然后去除并丢弃上清液 。

   注：如果处理的总细胞数少于 100,000 个且肉眼看不到离心后的细胞沉淀物 ，我们建议跳过下面的洗涤步骤 3-5，直接移至步骤 6。在步骤 2 中对细胞悬液进行初始离心后，可以去除并丢弃大部分上清液， 每反应留下 ≤ 40 µL 上清液。然后在步骤 6 中，向细胞悬液中加入足够的完全洗涤缓冲液， 使每反应的总体积达到 100 µL。

3. 轻轻上下吹打，于室温下用 1 mL 完整洗涤缓冲液重悬细胞沉淀物 。
4. 在室温下以 600 × g 的离心力离心 3 分钟，然后去除并丢弃上清液。
5. 重复步骤 3 和 4 一次，再次洗涤细胞沉淀物。
6. 每反应添加 100 µL 完整洗涤缓冲液，并轻轻上下吹打来重悬细胞沉淀物 。
7. 立即进入第 III 部分。

B. 组织样品制备

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 使用前彻底解冻 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 和 100X Spermidine #27287，并且在当天用毕后置于 -20°C 下储存。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 配制完全洗涤缓冲液（为每个组织类型制备 3 mL，为每个反应额外制备 100 µL）并保存于室温， 以最大限度减少细胞压力。例如，如果使用野生型和转基因肝脏 作为起始物料（2 种组织类型）并检测 4 种抗体（阳性对照 H3K4me3 #9751、阴性对照 IgG #2729 或 #68860，以及两种实验抗体；8 次反应），则需要总共 6.8 mL 完全洗涤缓冲液。

1. 针对每个反应称取 1 mg 新鲜组织。
2. 将组织样本放入盘中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是 将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
3. 用 1 mL 完全洗涤缓冲液重悬组织，并将样品转移到 Dounce 匀浆器中。
4. 用 20-25 个冲程将组织块分解成单细胞悬液， 直到观察不到组织块。
5. 将细胞悬液转移到 1.5 mL 试管中，并在室温下以 3,000 × g 的离心力离心 3 分钟， 并用移液管从细胞中去除并丢弃上清液。
6. 用 1 mL 完全洗涤缓冲液重悬细胞沉淀物。
7. 在室温下将细胞悬液以 3,000 × g 的离心力离心 3 分钟，然后去除并丢弃上清液 。
8. 重复步骤 6 和 7 一次，再次洗涤细胞沉淀物。
9. 每反应添加 100 µL 完整洗涤缓冲液，并轻轻上下吹打来重悬细胞沉淀物 。
10. 立即进入第三部分。

三、Concanavalin A 珠子和一抗的结合

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 将 Digitonin Solution #16359 在 90-100°C 下加温 5 分钟，并确保其完全解冻并呈溶液状态。 使用期间，立即将解冻的 Digitonin Solution #16359 置于冰上。当天用毕后，置于 -20°C 下储存。
• 使用前彻底解冻 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 和 100X Spermidine #27287，并且在当天用毕后置于 -20°C 下储存。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 每次反应制备 100 µL 完整的抗体结合缓冲液并置于冰上。

注：建议用于细胞通透的毛地黄皂苷的量为过量， 应足以满足大多数细胞系和组织类型的通透。然而，并非所有细胞系和组织对毛地黄皂苷 都表现出相同的敏感性。如果您的特定细胞系或组织在 推荐的毛地黄皂苷浓度下不起作用，您可以按照 附录 C 中提供的实验步骤来优化条件。毛地黄皂苷处理应能使 > 90% 的细胞群发生通透。

注：对于第三至第五部分中的所有孵育步骤，无需 通过摇动或旋转来混合样品。相反，我们建议只需将试管放在架子上，置于指定温度下即可。 在孵育步骤中混合样品不会改善检测性能。相反，旋转或摇晃 样品可能会导致珠子聚集增加，并因可能粘附在管壁和管盖上而造成珠子损失 。

注：如果您使用 Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit) #29811 或 Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse) #19629 进行样品归一化，请跳过本 CUT&Tag 实验步骤的第三部分，并遵循 spike-in 对照试剂盒的第一和第二部分。然后继续本 CUT&Tag 实验步骤的第四部分。

1. 将第一部分步骤 7 中制备的活化的 Concanavalin A 珠子平衡至室温，并通过轻轻地上下吹打来 彻底混合。
2. 每次反应向第二部分 A 中的步骤 6 或第二部分 B 中的步骤 9 中制备的细胞加入 10 µL 珠子悬液。
3. 通过上下吹打将样品充分混合。将样品在室温下孵育 5 分钟。
4. 将试管在磁力架上放置 30 秒至 2 分钟，然后去除并丢弃上清液。
5. 从磁力架上取下试管。每次反应添加 100 µL 完整的抗体结合缓冲液， 并通过移液管轻轻混合。
6. 按每次反应分装 100 µL 细胞珠子悬液到一个单独的 1.5 mL 管中，置于冰上。
7. 按每次反应添加适量的一抗，并上下吹打来轻柔混合。

   注：CUT&RUN 需要的抗体量会有所不同， 应由使用者确定。对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751，或阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 或 Normal Mouse IgG #68860，加入 2 µL 抗体到反应中。 如果可能，我们强烈建议 在检测中使用经 CUT&Tag 验证的抗体 。CST 提供一系列经 CUT&Tag 验证的 抗体，并附有支持性数据和适当的 稀释比例。

8. 在室温下孵育 1 小时。该步骤可以延伸至在 4°C 下过夜。
9. 立即进行第四部分。

四、二抗结合

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 将 Digitonin Solution #16359 在 90-100°C 下加温 5 分钟，并确保其完全解冻并呈溶液状态。 使用期间，立即将解冻的 Digitonin Solution #16359 置于冰上。当天用毕后，置于 -20°C 下储存。
• 使用前彻底解冻 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 和 100X Spermidine #27287，并且在当天用毕后置于 -20°C 下储存。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 每次反应新鲜制备 1.05 mL 毛地黄皂苷缓冲液，然后置于冰上。
  注：此处制备的洋地黄皂苷缓冲液将用于第 IV 和 V 部分。

1. 进行二抗预混合。对于每个反应，将 1 µL Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody #35401 或 1 µL Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody #52885 稀释至 50 μL 毛地黄皂苷缓冲液中。根据反应次数按比例扩大二抗 主混合物。轻轻上下吹打以混合，然后置于冰上。
2. 将含有来自第三部分步骤 7 的一抗孵育溶液的样品试管在磁力架上放置 30 秒至 2 分钟， 然后去除并丢弃上清液。
3. 向每个样品试管添加 50 µL 二抗预混合物，并轻轻上下吹打来混合样品。
4. 室温下孵育样品 30 分钟。
5. 立即进入第五部分。

五、pAG-Tn5 酶结合及酶切法片段化

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 确保 10% SDS Solution #20533 完全溶解。在 37°C 下加温 将有助于溶解 SDS 沉淀物。
• 将 Digitonin Solution #16359 在 90-100°C 下加温 5 分钟，并确保其完全解冻并呈溶液状态。 使用期间，立即将解冻的 Digitonin Solution #16359 置于冰上。当天用毕后，置于 -20°C 下储存。
• 使用前彻底解冻 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 和 100X Spermidine #27287，并且在当天用毕后置于 -20°C 下储存。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 每次反应制备 1.2 mL 高盐毛地黄皂苷缓冲液，然后置于冰上。

• 每次反应制备 150 µL 酶切法片段化缓冲液并置于冰上。

1. 对于每个反应，通过将 2 µL CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561 稀释于 50 µL 高盐毛地黄皂苷缓冲液中来制备 pAG-Tn5 主混合物。根据反应次数按比例增加 pAG-Tn5 主混合物。轻轻上下吹打以混合，然后置于冰上。
2. 将含有来自第四部分步骤 4 的二抗孵育溶液的样品试管在磁力架上放置 30 秒至 2 分钟， 然后去除并丢弃上清液。
3. 从磁力架上取下试管，加入 500 µL 在第四部分中制备的毛地黄皂苷缓冲液。轻轻上下吹打重悬珠子 。
4. 将试管在磁力架上放置 30 秒至 2 分钟，然后去除并丢弃上清液。
5. 重复步骤 3 和 4 一次，以进行第二次洗涤。
6. 从磁力架上取下试管。向每个试管添加 50 µL pAG-Tn5 预混合物， 并轻轻上下吹打来混合样品。
7. 在室温下孵育 1 小时。
8. 将试管在磁力分离架上放置 30 秒至 2 分钟，然后去除并丢弃 上清液。
9. 从磁力分离架上取下试管。添加 500 µL 高盐毛地黄皂苷缓冲液， 并轻轻上下吹打来重悬珠子。
10. 将试管在磁力架上放置 30 秒至 2 分钟，然后去除并丢弃上清液。
11. 重复步骤 9 和 10 一次，以进行第二次洗涤。
12. 从磁力架上取下试管。向每个试管添加 150 µL 酶切法片段化缓冲液，并上下吹打来混合 。
13. 在 37°C 下孵育样品 1 小时。
14. 要停止酶切法片段化，向每个样品中添加 6.75 µL 0.5 M EDTA, pH 8.0 #7011、8.25 µL 10% SDS Solution #20533 和 1.5 µL Proteinase K (20 mg/mL) #10012，然后快速涡旋搅拌以混合。
15. 将样品在 58°C 下孵育 1 小时，将标记的染色质片段释放到溶液中。这次孵育 可以延长至过夜。如果孵育过夜，请使用可封盖的试管以防止样品蒸发。

    注：如果从固定细胞或组织开始，则在 65°C 下将样品置于可封盖的试管中孵育 2 小时，以充分解交联。这次孵育可以延长过夜。

16. 在室温下将试管以 16,000 × g 的离心力离心 2 分钟，然后将试管置于磁力架上 30 秒至 2 分钟。
17. 将上清液转移到新的 1.5 mL 管中。这些是要纯化的 CUT&Tag DNA 样品。
18. 继续进行第六部分。（安全停止）或者， 样品可于 -20°C 下储存长达 1 周。但在 DNA 纯化（第六部分）之前，请确保将样品加热到室温。

六、DNA 纯化

开始之前：

!! 使用前向 DNA Binding Buffer 中加入 8 mL 异丙醇。跳过此 步骤将导致您的 DNA 样本完全丢失。在第一组 DNA 纯化之前， 只需要添加一次。

!! 使用前添加 24 mL 乙醇 (96-100%) 到 DNA Wash Buffer 中。在第一组 DNA 纯化之前， 只需要添加一次。

• 使用前请将 DNA 纯化柱、DNA Binding Buffer、DNA Wash Buffer 和 DNA Elution Buffer 平衡至室温 。

1. 对于每个待纯化的 CUT&Tag DNA 样品，准备一个 DNA 纯化收集管。
2. 向每份 CUT&Tag DNA 样品添加 833 µL DNA Binding Buffer（+ 异丙醇），通过上下吹打以混合。

   注：每 1 体积的样品应使用 5 体积的 DNA Binding Buffer（+ 异丙醇）。

3. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取 600 µL 并将其转移至收集管中的 DNA 离心柱内。
4. 用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心 30 秒。
5. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。将离心柱放回 空的收集管中。
6. 重复步骤 2-4，直到步骤 1 中的整个样品已经过离心柱旋转。将离心柱放回 空的收集管中。
7. 向收集管中的离心柱添加 750 µL DNA Wash Buffer（+ 乙醇）。
8. 用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心 30 秒。
9. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。将离心柱放回空的 收集管中。
10. 用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心 30 秒。
11. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
12. 向每个离心柱添加 30 µL DNA Elution Buffer，并放在干净的 1.5 mL 管中。

    注：要从离心柱中完全洗脱 DNA，需要至少 30 µL 的 DNA 洗脱缓冲液。

13. 用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心 30 秒，以洗脱 DNA。
14. 取出并丢弃 DNA 离心柱。此时的洗脱物即纯化的 DNA。（安全 停止）样品 可于 -20°C 下储存长达 6 个月。

    注：考虑到 CUT&Tag DNA 的产量通常较低，我们强烈建议使用 全部 30 µL DNA 样品进行文库扩增。

七、下一代测序分析 (NGS) 文库构建

用本试剂盒制备的免疫富集 DNA 样品直接兼容 NGS。要构建下游 NGS DNA 文库，请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒 。对于在 Illumina Systems 平台上测序，我们建议使用 CUT&Tag Dual Index Primers 和 PCR Master Mix for Illumina Systems #47415。请注意，DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 和 Multiplex Oligos for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 #47538 与 CUT&Tag DNA 样品不兼容。

DNA 文库制备的其他建议：

• 已扩增的 CUT&Tag DNA 文库的产量可能因所使用的 DNA 定量方法而异。
• 如果使用 Nanodrop 或 QIAxpert 系统，组蛋白靶标的预期读数为 10-20 ng/µL，非组蛋白靶标的预期读数为 5-12 ng/µL。如果采用 Nanodrop 或 QIAxpert 系统时文库浓度 < 3 ng/µL，在对样品测序之前，请参阅疑难解答指南 。
• 如果使用 Qubit 荧光定量系统或 Picogreen 测定法，组蛋白靶标的预期读数为 3-10 ng/µL，非组蛋白靶标的预期读数可能 < 1 ng/µL。
• 有关混合产量不一的样品的更多指导，或需要获取支持数据，请 参阅 我们的 CUT&Tag 常见问答网页。
• 由于 CUT&Tag 检测的 DNA 产量较低，对 DNA 文库进行质量评估可能 具有挑战性。
• 当使用 Bioanalyzer 系统时，DNA 浓度极低的文库可能会生成峰极弱甚至无可见峰的 谱图 ，特别是对于细胞中丰度不高的靶点尤其如此。在这些情况下， 如果阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 产生预期的文库产量 和/或 Bioanalyzer 峰，这表明在总体上来讲实验是成功的，我们仍然建议继续进行 NGS。
• TapeStation 系统上的高灵敏度 ScreenTape 检测方法由于其优化的荧光化学和降低的基线噪声，为 CUT&Tag 文库质量评估提供了一种更优的方法。
• 无论靶标类型如何，每份样品 200 万个读数的测序深度通常足以进行 CUT&Tag 检测。如果每份样品的测序深度大于 1,500 万， 则读数的重复率显著增加。如果每份样品的测序深度 < 100 万读数，则信噪比会降低。
• 如果起始细胞数 < 20,000 个，在 NGS 读数中获得较低的比对率或较高的重复率是很常见的 。如果发生这种情况，我们建议增加测序深度以获得足够的唯一比对读数， 用于下游数据分析。
• 如果使用果蝇 spike-in 核进行样品归一化， 关于 NGS 分析的更多指导，请参阅 Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit) #29811 或 Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse) #19629 实验步骤中的第三部分。

附录 A：固定细胞制备

我们强烈建议尽可能使用活细胞。对于某些脆弱或对 Concanavalin A 敏感的细胞类型，在进行 CUT&Tag 实验之前，请参阅下面的实验步骤，以对细胞进行略微固定。 请注意，细胞固定并不显著增加 CUT&Tag 信号。事实上，过度固定可能导致 CUT&Tag 信号更弱。请参阅第二部分中的描述，以确定每次反应中相应的 细胞数量。

注：固定细胞制备需要以下试剂，这些试剂不包含在此试剂盒中 ：37% 甲醛或 16% Formaldehyde, Methanol-Free #12606 和 Glycine Solution (10X) #7005。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 对于每 1 mL 待处理的细胞悬液，制备 2.7 µL 37% 甲醛或 6.25 µL 16% Formaldehyde, Methanol-Free #12606 并置于室温下保存。使用在制造商标示的有效期内的新鲜甲醛。
• 使用前彻底解冻 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 和 100X Spermidine #27287，并且在当天用毕后置于 -20°C 下储存。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 制备完全洗涤缓冲液（为每份细胞制备物制备 2 mL，为每个 CUT&Tag 反应额外制备 100 µL）并保存于室温。例如，如果同时使用未经处理的细胞和经药物处理的细胞（2 份细胞制备物）并用 4 种抗体检测（阳性对照 H3K4me3 #9751、阴性对照 IgG #2729 或 #68860，以及两种实验性抗体；8 次反应），则需要总共 4.8 mL 完全洗涤缓冲液。

1. 每个反应收获 100,000 个活细胞。

   注：对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来，并用至少 3 倍体积的组织培养基中和。我们不建议从培养皿刮取细胞， 以防细胞裂解。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器准确计数细胞， 以确保实验中使用正确数量的细胞。

2. 每 1 mL 细胞悬液添加 2.7 µL 37% 甲醛或 6.25 µL 16% Formaldehyde, Methanol-Free #12606，以实现 0.1% 甲醛的最终浓度。旋转试管混匀并置于室温下孵育 2 分钟。
3. 每 1 ml 固定细胞悬液添加 100 µL Glycine Solution (10X) #7005 以停止交联。旋转试管混匀并置于室温下孵育 5 分钟。
4. 在 4°C 下将细胞悬液以 3,000 × g 的离心力离心 3 分钟，然后去除并丢弃上清液。 立即进入第 5 步。（安全停止） 或者，固定的细胞沉淀物可以在使用前储存在 -80°C 下长达 6 个月。

   注：如果处理的细胞总数少于 100,000 个并且离心的细胞沉淀物肉眼不可见， 我们不建议冷冻细胞沉淀物。相反，我们建议继续执行该实验步骤 并跳过以下洗涤步骤 5 至 7。在步骤 4 中对细胞悬液进行初始离心后， 去除并丢弃大部分上清液，每反应留下 ≤ 40 µL 细胞培养基。然后在步骤 8 中，向细胞悬液中加入足够的完全洗涤缓冲液， 使每反应的总体积达到 100 µL。

5. 用 1 mL 完整洗涤缓冲液通过轻轻上下吹打来重悬细胞沉淀物。
6. 在 4°C 下以 3,000 × g 的离心力离心 3 分钟，然后去除并丢弃上清液。
7. 重复步骤 5 和 6 一次，再次洗涤细胞沉淀物。
8. 对于每次反应，添加 100 µL 完整洗涤缓冲液，并轻轻上下吹打来 重悬细胞沉淀物。
9. 立即进入第 III 部分。

附录 B：固定的组织样品制备

对于大多数组织类型，1 mg 新鲜组织足以产生稳健的组蛋白富集。如果不可获取新鲜组织， 可使用略微固定的组织（0.1% 甲醛，2 分钟）。固定的组织样品可以在使用前于 -80°C 下冷冻长达 6 个月。过度固定可能导致 CUT&Tag 信号较弱。 CUT&Tag 检测对从组织富集转录因子和辅因子效果不佳。对于 分析转录因子和辅因子，我们建议使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。

注：固定组织制备需要以下试剂，这些试剂不包含在此试剂盒中 ：37% 甲醛或 16% Formaldehyde, Methanol-Free #12606、 Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872 和 Glycine Solution (10X) #7005。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 对于每 1 mL 待处理的细胞悬液，制备 2.7 µL 37% 甲醛或 6.25 µL 16% Formaldehyde, Methanol-Free #12606 并置于室温下保存。使用在制造商标示的有效期内的新鲜甲醛。
• 每 1 mL 固定缓冲液制备 100 µL Glycine Solution (10X) #7005。
• 使用前彻底解冻 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 和 100X Spermidine #27287，并且在当天用毕后置于 -20°C 下储存。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 配制完全洗涤缓冲液（为每个组织类型制备 3 mL，为每个反应额外制备 100 µL）并保存于室温， 以最大限度减少细胞压力。

• 针对每个组织类型制备 1 mL 固定缓冲液。使用在 制造商 标示的有效期内的新鲜甲醛。

• 针对每个组织类型制备 1 mL 固定洗涤缓冲液并置于冰上。

1. 针对每个反应称取 1 mg 新鲜组织。
2. 将组织样本放入盘中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。将培养皿置于冰上保存。 重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
3. 将切碎的组织立即转移到 1 mL 固定缓冲液中，并旋转试管以混合。

   注：此体积的固定缓冲液足以处理多达 50 mg 的组织。如果处理 > 50 mg， 则相应地增加步骤 3 中所用固定缓冲液和步骤 7 中所用固定洗涤缓冲液的量。

4. 室温孵育 2 分钟。
5. 每 1 mL 固定缓冲液添加 100 µL Glycine Solution (10X) #7005 以停止交联。旋转试管混匀并置于室温下孵育 5 分钟。
6. 在 4°C 下将组织以 2,000 × g 的离心力离心 5 分钟，然后去除并丢弃上清液。
7. 用 1 mL 固定洗涤缓冲液重悬组织。
8. 在 4°C 下以 2,000 × g 的离心力离心 5 分钟，去除并丢弃上清液，然后进行步骤 9。 （安全停止）或者，固定的组织沉淀物可以在解离前储存在 -80°C 下 长达 6 个月。
9. 用 1 mL 完全洗涤缓冲液重悬组织，并将样品转移到 Dounce 匀浆器中。
10. 用 20-25 个冲程将组织块分解成单细胞悬液， 直到观察不到组织块。
11. 将细胞悬液转移到 1.5 mL 试管中，并在室温下以 3,000 × g 的离心力离心 3 分钟， 然后从细胞中去除并丢弃上清液。
12. 用 1 mL 完全洗涤缓冲液重悬细胞沉淀物。
13. 在室温下将细胞悬液以 3,000 × g 的离心力离心 3 分钟，然后去除并丢弃上清液 。
14. 重复步骤 12 和 13 一次，再次洗涤细胞沉淀物。
15. 对于每次反应，添加 100 µL 完整洗涤缓冲液，并轻轻上下吹打来 重悬细胞沉淀物。
16. 立即进入第三部分。

附录 C：测试细胞对洋地黄皂苷的敏感性

在 CUT&Tag 实验步骤中，向缓冲液添加毛地黄皂苷促进了细胞膜通透 以及一抗、二抗和 pAG-Tn5 酶进入细胞和胞核。因此， 缓冲液中有足量的毛地黄皂苷对抗体与酶成功结合 及消化靶向的基因座至关重要。不同细胞系对毛地黄皂苷细胞通透展现出 不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的毛地黄皂苷量应足以 对大多数细胞系或组织进行通透，但您可以使用本实验步骤测试您的特定细胞系或组织 。我们发现，添加过量的毛地黄皂苷对本实验没有损害， 因此无需生成浓度曲线。相反，进行快速测试以确定建议的毛地黄皂苷量 是否适用于您的细胞系就足够了。

开始之前：

• 将 Digitonin Solution #16359 在 90-100°C 下加温 5 分钟，并确保其完全解冻并呈溶液状态。 使用期间，立即将解冻的 Digitonin Solution #16359 置于冰上。当天用毕后，置于 -20°C 下储存。
• 每反应制备 100 µL 1X 洗涤缓冲液。此检测无需添加 100X Spermidine #27287 或 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 。

1. 在 1.5 mL 试管中，采集 100,000 个细胞（来自第二部分 A 中的步骤 1），在室温下以 600 × g 的离心力离心 3 分钟， 并抽取上清液。对于组织，从 1 mg 组织中收集分解的细胞（来自 第二部分 B 中的步骤 1-8）。
2. 用 100 µL 1X 洗涤缓冲液重悬细胞沉淀物。
3. 将 2.5 µL Digitonin Solution #16359 添加到每次反应中，并在室温下孵育 10 分钟。
4. 将 10 µL 细胞悬液与 10 µL 0.4% 台盼蓝染液混合。
5. 使用血细胞计数器或细胞计数器计算染色细胞的数量和细胞总数。 充分通透会导致 > 90% 的细胞着染台盼蓝。
6. 如果被台盼蓝染色的细胞量 < 90%，则增加每个反应中的 Digitonin Solution #16359 添加量，并重复步骤 1-5，直到 > 90% 的细胞被 通透和染色。在第三至第五部分中采用这一 Digitonin Solution #16359 的量。

附录 D：疑难排解指南

如需详细的疑难排解指南，请访问 cellsignal.com/learn-and-support/troubleshooting/cutandtag-troubleshooting-guide

附录 E：在线资源

有关 CUT&Tag 检测的博客、常见问题解答和更多信息，请访问我们的 CUT&Tag 资源中心，网址为 cellsignal.com/applications/cut-tag，或扫描下面的二维码。

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