CUT&Tag 试剂盒实验步骤

I. Concanavalin A 珠子的激活

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 将 Concanavalin A Bead Activation Buffer 放在冰上。

1. 确定需进行的 CUT&Tag 反应次数。我们强烈建议包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 的反应。阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 或 Normal Mouse IgG #68860 是可选的，取决于要使用的峰值调用算法的要求。

2. 通过轻轻上下吹打小心地把 Concanavalin A 磁珠重新悬浮到均匀的浆液中，确保不要将任何磁珠悬浮液溅出试管。 

注：在整个实验步骤中避免将 Concanavalin A 磁珠悬浮液涡旋，因为反复涡旋可能会使 Concanavalin A 从珠子中移位。

3. 按照每个 CUT&Tag 反应，将 10 µl 珠子悬浮液转移到一个新的 1.5 ml 微量离心管中。如果计划一次进行多次 14 CUT&Tag 反应，请使用两个或更多个 1.5 ml 微量离心管。每 1.5 ml 微量离心管中应加入不超过 140 μl 的 Concanavalin A 珠子。

4. 每 10 µl 珠子添加 100 µl Concanavalin A Bead Activation Buffer。上下吸打来轻轻混合珠子。

5. 将试管在磁力架上放置 30 秒钟至 2 分钟，然后使用移液管去除上清液。 

注：为避免丢失珠子，在整个实验步骤中请勿使用真空来抽吸。

6. 从磁力架上取下试管。重复步骤 4 和 5 来二次洗涤珠子。

7. 添加一体积的 Concanavalin A Bead Activation Buffer，体积等同于初始的重悬珠子的液体体积（每次反应 10 µl），上下吹打重悬。 

注：活化的珠子可在冰上储存长达 8 小时。

II. 细胞和组织制备

对于大多数细胞类型，活细胞可用于 CUT&Tag 检测，以产生强大的组蛋白、转录因子和辅因子富集。我们强烈建议尽可能使用活细胞。对于某些脆弱或对 Concanavalin A 敏感的细胞类型，请参阅附录 A，以了解 CUT&Tag 之前的细胞光固定实验步骤。请注意，细胞固定不会增加 CUT&Tag 信号，过度固定可能对酶切法片段化（Tagmentation）反应有害。 

新鲜组织也可用于 CUT&Tag 测定，以产生大量的组蛋白富集。然而，转录因子和辅因子等非组蛋白靶标在 CUT&Tag 检测中并未得到很好的富集。为了分析组织中的转录因子和辅因子，我们建议使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。新鲜组织通常会产生与固定组织相当或更强的 CUT&Tag 信号。如果需要固定，请参阅附录 B，以了解 CUT&Tag 实验之前组织的光固定实验步骤。

我们的 CUT&Tag 检测适用于各种不同的细胞和组织类型以及各种起始材料量。我们建议每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织。如果起始细胞数量有限，则组蛋白修饰靶标每次反应可能只需要 5,000 到 10,000 个细胞，转录因子和辅因子每次反应可能需要 20,000 个细胞。低输入反应的成功取决于靶标丰度和抗体敏感性。足够量的起始材料对于所需的 CUT&Tag 信号至关重要，特别是对于转录因子和辅因子。每次反应最多可使用 250,000 个细胞或 5 mg 组织。一次反应中使用的整个实验步骤的缓冲液体积不需要根据细胞数量或组织质量进行调整，只要这些值落在指定范围内（5,000-250,000 细胞或 1-5 mg 组织）即可。当有说明时，所有缓冲液的体积需要根据正在进行的反应次数按比例调整。 

推荐用于细胞透化的毛地黄皂苷的量过多，应该足以用于大多数细胞系和组织类型的透化。然而，并非所有细胞系和组织对毛地黄皂苷都表现出相同的敏感性。如果您的特定细胞系或组织在推荐的洋地黄皂苷浓度下不起作用，您可以按照附录 C 中提供的实验步骤来优化条件。洋地黄皂苷处理应导致 >90% 的细胞群透化。

A. 活细胞制备

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 使用前，彻底解冻 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287，当天完成后，将其储存在 -20°C 下。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail #7012 置于冰上时会重新冻结。

• 制备完整的洗涤缓冲液（每个细胞制备物为 2 ml，每个 CUT&Tag 反应额外添加 100 μl），并在室温下保存。例如，如果同时使用未经处理和经药物处理的细胞（2 个细胞制备物）并进行 4 个抗体检测（阳性对照 H3K4me3 #9751、阴性对照 IgG #2729 或 #68860 以及两种实验抗体；8 次反应），则总共需要 4.8 ml 完整的洗涤缓冲液。

注：活性细胞制备的所有步骤应在室温下连续进行，以尽量减少对细胞的压力。请勿涡旋细胞样品，以避免 DNA 片段化和细胞空化。

1. 在室温下针对每次反应收集 100,000 个活性细胞，以尽量减少对细胞的压力。 

注：对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶将其从培养皿中分离，并用至少 3 个体积的组织培养基进行中和。我们不建议从培养皿中刮下细胞，以防止细胞裂解。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行准确计数，以确保用于实验的细胞数量正确无误。

2. 将细胞悬液在室温以 600 x g 离心 3 分钟，然后移除上清液。

注：如果使用的细胞数量少于 100,000 个总细胞，并且肉眼看不到离心的细胞沉淀物，我们建议跳过下面的洗涤步骤 3 至 5，直接进入步骤 6。在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后，去除大部分上清液，每次反应留下 ≤40 µl 上清液。然后在步骤 6 中，向细胞悬浮液中添加足够的完整洗涤缓冲液，以使每次反应的总体积达到 100 µl。

3. 轻轻上下摇晃，于室温下在 1 ml 完整洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。

4. 在室温下以 600 x g 的速度离心分离 3 分钟，然后移除上清液。

5. 重复步骤 3 和 4 一次，以再次清洗细胞沉淀物。

6. 针对每次反应，添加 100 µl 完整洗涤缓冲液，并轻轻上下摇晃移液管来重悬细胞沉淀物。

7. 立即进入第 III 部分。

B. 组织样品制备

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 使用前，彻底解冻 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287，当天完成后，将其储存在 -20°C 下。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail #7012 置于冰上时会重新冻结。

• 制备完整的洗涤缓冲液（每种组织类型制备 3 ml，每个反应额外添加 100 μl），并在室温下保存，以尽量减少对细胞的压力。例如，如果使用野生型和转基因肝脏作为起始材料（2 种组织类型）并进行 4 个抗体检测（阳性对照 H3K4me3 #9751、阴性对照 IgG #2729 或 #68860 以及两种实验抗体；8 次反应），则总共需要 6.8 ml 完整的洗涤缓冲液。

1. 针对每个反应称取 1 mg 新鲜组织。 

2. 将组织样本放入盘中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。

3. 将组织重悬在 1 ml 完全洗涤缓冲液中，并将样品转移到 Dounce 匀浆器中。 

4. 用 20-25 个冲程将组织块分解成单细胞悬浮液，直到观察不到组织块。

5. 将细胞悬液转移到 1.5 ml 管中，并在室温下以 3,000 x g 的速度离心 3 分钟，并用移液管从细胞中去除上清液。

6. 在 1 ml 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。

7. 将细胞悬液在室温以 3,000 x g 离心 3 分钟，然后移除上清液。

8. 重复步骤 6 和 7 一次，以再次清洗细胞沉淀物。

9. 针对每次反应，添加 100 µl 完整洗涤缓冲液，并轻轻上下摇晃移液管来重悬细胞沉淀物。

10. 立即进入第 III 部分。

III. 刀豆球蛋白 A 珠子和一抗的结合

注：对于第 III-V 部分中的所有孵育步骤，无需通过摇动或旋转来混合样品。相反，我们建议只需将样品试管放在指定温度的架子上即可。在孵育步骤中混合样品不会提高测定的性能。相反，旋转或摇动样品，珠子可能会粘附在管壁和盖子上，从而导致更多的珠子结块和损失。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 在 90-100°C 下将 Digitonin Solution #16359 加热 5 分钟，并确保完全解冻并溶解。使用过程中，立即将解冻后的 Digitonin Solution #16359 置于冰上。当天完成后，储存在 -20°C 下。

• 使用前，彻底解冻 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287，当天完成后，将其储存在 -20°C 下。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail #7012 置于冰上时会重新冻结。

• 每次反应制备 100 μl 完整的抗体结合缓冲液并置于冰上。

1. 通过轻轻地上下吹打，彻底混合第 I 部分步骤 7 中准备的活化的 Concanavalin A 珠子。在 II-A 部分步骤 6 或 II-B 部分步骤 9 中制备的洗涤细胞悬浮液中，应添加珠子悬浮液。

2. 将样品在室温下孵育 5 分钟。

3. 将试管在磁力架上放置 30 秒钟至 2 分钟，然后取出并丢弃上清液。

4. 从磁力架上取下试管。每次反应添加 100 μl 完整的抗体结合缓冲液，并通过移液管轻轻混合。

5. 按每次反应分装 100 µl 细胞珠子悬液到一根单独的 1.5 ml 试管中，并放在冰上。

6. 按每次反应添加适量的一抗，并上下吹打来轻柔混合。

注：CUT&Tag 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 或阴性对照 Normal Rabbit IgG # 2729或 Normal Mouse IgG #68860，向反应中添加 2 μl 抗体。如果可能，我们强烈建议在检测中使用经 CUT&Tag 验证的抗体。CST 提供一系列经 CUT&Tag 验证的抗体，包括支持数据和适当的稀释比例。

7. 在室温下孵育样品 1 小时。该步骤可以延长到在 4°C 下过夜。 

8. 立即进行第四部分。

IV. 二抗结合

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 在 90-100°C 下将 Digitonin Solution #16359 加热 5 分钟，并确保完全解冻并溶解。使用过程中，立即将解冻后的 Digitonin Solution #16359 置于冰上。当天完成后，储存在 -20°C 下。

• 使用前，彻底解冻 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287，当天完成后，将其储存在 -20°C 下。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail #7012 置于冰上时会重新冻结。

• 每次反应新鲜制备 1.05 ml 洋地黄皂苷缓冲液，然后置于冰上。  

注： 此处制备的洋地黄皂苷缓冲液将用于第 IV 和 V 部分。

1. 进行二抗预混合。对于每次反应，将 1 μl Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody #35401 或 1 µl Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody #52885 稀释至 50 μl 洋地黄皂苷缓冲液中。根据反应次数按比例增加二抗预混液。轻轻地上下吹打混合，然后置于冰上。

2. 将含有第 III 部分步骤 7 一抗孵育溶液的样品试管在磁力架上放置 30 秒至 2 分钟，然后去除上清液。

3. 向每个样品试管添加 50 µl 二抗预混合物，并轻轻上下吹打来混合样品。

4. 室温下孵育样品 30 分钟。 

5. 立即进入第五部分。

V.pAG-Tn5 酶结合及酶切法片段化（Tagmentation）

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 确保 10% SDS Solution #20533 完全溶于溶液中。在 37°C 下加热有助于溶解 SDS 沉淀物。

• 在 90-100°C 下将 Digitonin Solution #16359 加热 5 分钟，并确保完全解冻并溶解。使用过程中，立即将解冻后的 Digitonin Solution #16359 置于冰上。当天完成后，储存在 -20°C 下。

• 使用前，彻底解冻 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287，当天完成后，将其储存在 -20°C 下。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail #7012 置于冰上时会重新冻结。

• 每次反应制备 1.2 ml 高盐洋地黄皂苷缓冲液并置于冰上。

• 每次反应制备 150 μl 酶切法片段化（Tagmentation）缓冲液并置于冰上。

1. 对于每次反应，通过将 2 µl CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561 稀释至 50 μl 高盐洋地黄皂苷缓冲液中，来制备 pAG-Tn5 预混液。根据反应次数按比例增加 pAG-Tn5 预混液。轻轻地上下吹打混合，然后置于冰上。

2. 将含有第 IV 部分步骤 4 一抗孵育溶液的样品试管在磁力架上放置 30 秒至 2 分钟，然后去除上清液。

3. 从磁力架上取下试管，加入 500 µl 在第 IV 部分中制备的洋地黄皂苷缓冲液。轻轻上下吹打重悬珠子。

4. 将试管在磁力架上放置 30 秒钟至 2 分钟，然后去除上清液。

5. 重复步骤 3 和 4 一次，以进行第二次洗涤。

6. 从磁力架上取下试管。向每根试管添加 50 µl pAG-Tn5 预混合物，并轻轻上下吹打来混合样品。

7. 在室温下孵育 1 小时。

8. 将试管在磁力分离架上放置 30 秒钟至 2 分钟，然后去除上清液。

9. 从磁分离架上取下试管。添加 500 µl 高盐洋地黄皂苷缓冲液，并轻轻上下吹打来重悬珠子。

10. 将试管在磁力架上放置 30 秒钟至 2 分钟，然后去除上清液。

11. 重复步骤 9 和 10 一次，以进行第二次洗涤。

12. 从磁力架上取下试管。向每支试管添加 150 μl 酶切法片段化（Tagmentation）缓冲液，并上下吹打以混合。

13. 在 37°C 下孵育样品 1 小时。

14. 要停止酶切法片段化（Tagmentation），向每个样品中添加 6.75 μl 0.5 M EDTA #7011、8.25 μl 10% SDS #20533和 1.5 μl 20 mg/mL Proteinase K #10012，然后快速涡旋以混合。

15. 将样品在 58°C 下孵育 1 小时，将标记的染色质片段释放到溶液中。这次孵育可以延长过夜。如果孵育过夜，请使用有安全锁的试管以防止样品蒸发。

注：如果从固定细胞或组织开始，则在 65°C 下将样品置于有安全锁的试管中孵育 2 小时，以充分解交联。这种孵育可以延至过夜。

16. 在室温下以 16,000x g 的速度离心 2 分钟，然后将试管置于磁力架上 30 秒钟至 2 分钟。

17. 将上清液转移到新的 1.5 ml 试管中。这些是要纯化的 CUT&Tag DNA 样品。

18. 继续执行第 VI 部分。（安全停止）或者，样品可以在 -20°C 下保存长达 1 周。然而，在 DNA 纯化之前，请务必将样品加热至室温（第 VI 部分）。

VI. DNA 纯化

开始之前：

• 使用前请将 DNA 纯化柱、DNA 结合缓冲液、DNA 洗涤缓冲液和 DNA 洗脱缓冲液平衡至室温。

• !!使用前，向 DNA 洗涤缓冲液中添加 24 ml 乙醇 (96-100%)。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。

• 对于每个待纯化的 CUT&Tag DNA 样品，使用一个 DNA 纯化收集管。

1. 向每份 CUT&Tag DNA 样品添加 833 μl DNA 结合缓冲液，通过上下吹打以混合。

注：每 1 体积的样品应使用 5 体积的 DNA 结合缓冲液。

2. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出 600 μl 并将其至收集管的 DNA 离心柱中。

3. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。

4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。将离心柱放回空的收集管。

5. 重复步骤 2-4，直到步骤 1 中的整个样品已经过离心柱旋转。将离心柱放回空的收集管。

6. 向收集管的离心柱添加 750 μl DNA Wash Buffer。

7. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。

8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。将离心柱放回空的收集管。

9. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。

10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。

11. 向每根离心柱添加 30 μl DNA 洗脱缓冲液，并放在干净的 1.5 ml 管中。 

注：为了从柱中完全洗脱 DNA，需要最小体积为 30 µl 的 DNA 洗脱缓冲液。

12. 用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心分离 30 秒，以洗脱 DNA。

13. 取出并丢弃 DNA 旋转柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。（安全停止）样品可在 -20°C 下保存长达 6 个月。

注：考虑到 CUT&Tag DNA 的产量通常较低，我们强烈建议使用所有 30 µl DNA 样品进行文库扩增。

VII. NG-Sequencing文库构建

使用该试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品与 NG-seq 直接兼容。对于下游 NG-seq DNA 文库构建，请使用与下游测序平台兼容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于 Illumina Systems 平台上的测序，我们建议使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415。请注意，DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 和 Multiplex Oligos for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 #47538 与 CUT&Tag DNA 样品不兼容。

DNA 文库制备的其他建议：

• 已扩增的 CUT&Tag DNA 文库的产量可能因所使用的 DNA 定量方法而异。如果使用 Nanodrop 或 QIAxpert 系统，组蛋白靶标的预期读数为 10-20 ng/μl，非组蛋白靶标的预期读数为 5-12 ng/µl。如果 Nanodrop 或 QIAxpert 系统的文库浓度低于 3 ng/µl，请在对样品进行测序之前参阅疑难解答指南。如果使用 Qubit 荧光定量系统或 Picogreen 检测法，组蛋白靶标的预期读数为 3-10 ng/μl，非组蛋白靶标的预期读数可能低于 1 ng/µl。由于浓度较低，Bioanalyzer 或 TapeStation 系统生成的谱图中可能会看到极弱的峰甚或看不到可见峰，特别是对于细胞中不丰富的靶标。在这些情况下，如果阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 产生预期的文库产量和/或 Bioanalyzer 峰，这表明在总体上来讲实验是成功的，我们仍然建议继续进行 NGS。请参阅我们的 CUT&Tag 常见问题解答网页以获取支持数据，或获取合并不同产量样本的其他建议。

• 无论靶标类型如何，每个样本 200 万个读数的测序深度通常足以进行 CUT&Tag 测定。如果每份样品的测序深度大于 1500 万，则读取的重复率显著增加。如果每份样品的测序深度低于一百万个读数，则信噪比会降低。

• 对于少于 20,000 个起始细胞数，在 NGS 读取中获得较低的映射率或较高的重复率是很常见的。如果发生这种情况，我们建议增加测序深度以获得足够的唯一映射读取用于下游数据分析。 

附录 A：固定细胞制备

我们强烈建议尽可能使用活细胞。对于某些对伴刀豆球蛋白 A 脆弱或敏感的细胞类型，请在 CUT&Tag 实验之前参考下面的实验步骤略微固定细胞。请注意，细胞固定并不显著增加 CUT&Tag 信号。事实上，过度固定可能导致 CUT&Tag 信号更弱。请参阅第 II 部分中的描述，以确定每个反应中相应的细胞数量。 

注：固定细胞制备需要以下试剂，不包含在此试剂盒中：37% 甲醛或 16% 无甲醇的甲醛 #12606，甘氨酸溶液 (10X) #7005。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 每 1 ml 待处理细胞悬液，配制 2.7 µl 37% 甲醛液或 6.25 µl 16% Formaldehyde, Methanol-Free #12606 并室温保存。使用制造商规定的有效期内的新鲜甲醛。

• 使用前，彻底解冻 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287，当天完成后，将其储存在 -20°C 下。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail #7012 置于冰上时会重新冻结。

• 制备完整的洗涤缓冲液（每个细胞制备物为 2 ml，每个 CUT&Tag 反应额外添加 100 µl）并将其保存在室温下。例如，如果同时使用未经处理和经过药物处理的细胞（2 个细胞制备物）并进行 4 个抗体检测（阳性对照 H3K4me3 #9751、阴性对照 IgG #2729 或 #68860，以及两种实验抗体；8 次反应），则总共需要 4.8 ml 完整洗涤缓冲液。

1. 每个反应收获 100,000 个活细胞。 

注：对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶将其从培养皿中分离出来，并用至少 3 个体积的组织培养基进行中和。我们不建议从培养皿中刮下细胞，以防止细胞裂解。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行准确计数，以确保用于实验的细胞数量正确无误。

2. 每 1 ml 细胞悬液添加 2.7 µl 37% 甲醛或 6.25 µl 16% 无甲醇的甲醛 #12606，以实现 0.1% 甲醛终浓度。旋转混匀并置于室温下孵育 2 分钟。

3. 每 1 ml 固定细胞悬浮液中添加 100 µl Glycine Solution (10X) #7005 来停止交联。旋转试管以混合并在室温下孵育 5 分钟。

4. 在 4°C下以 3,000 x g 的离心速度把细胞悬浮液离心 3 分钟，并除去上清液。立即进行步骤 5。（安全停止）或者，固定的细胞沉淀物在使用前可在 -80°C 下保存长达 6 个月。

注：如果使用的细胞少于 100,000 个总细胞，并且肉眼看不到离心的细胞沉淀物，我们不建议冷冻细胞沉淀物。相反，我们建议继续执行该实验步骤并跳过下面的洗涤步骤 5 至 7。在步骤 4 中对细胞悬浮液进行初始离心后，去除大部分上清液，每次反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在步骤 8 中，向细胞悬浮液中添加足够的完整洗涤缓冲液，以使每次反应的总体积达到 100 µl。

5. 通过柔和上下吹打，在 1 ml 完全洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。

6. 在 4°C 下以 3,000 x g 的速度离心 3 分钟，然后移除上清液。

7. 重复步骤 5 和 6 一次，以再次清洗细胞沉淀物。 

8. 针对每个反应，添加 100 µl 完全洗涤缓冲液，并通过柔和上下吹打来重悬细胞沉淀物。

9. 立即进入第 III 部分。

附录 B：固定的组织样品制备

对于大多数组织类型，1 mg 的新鲜组织足以产生组蛋白的强烈富集。如果无法获得新鲜组织，可以使用轻微固定的组织（0.1% 甲醛需 2 分钟）。固定的组织样品在使用前可在 -80°C 下冷冻长达 6 个月。过度固定可能会导致 CUT&Tag 信号变弱。CUT&Tag 测定不能很好地富集组织中的转录因子和辅因子。对于转录因子和辅因子的分析，我们建议使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。

注：固定组织制备需要以下试剂，不包含在此试剂盒中：37% 甲醛或 16% 无甲醇的甲醛 #12606、磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872 和甘氨酸溶液 (10X) #7005。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例增加。

• 每 1 ml 待处理细胞悬液，配制 2.7 µl 37% 甲醛液或 6.25 µl 16% Formaldehyde, Methanol-Free #12606 并室温保存。使用在制造商标示的有效期内的新鲜甲醛。

• 每 1 ml 固定缓冲液制备 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005。

• 使用前，彻底解冻 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287，当天完成后，将其储存在 -20°C 下。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail #7012 置于冰上时会重新冻结。

• 配制完全洗涤缓冲液（3 ml 用于每个组织类型，额外 100µl 用于每个反应 ）并保存于室温，以最大限度减少细胞应激。 

• 针对每个组织类型配制 1 ml 固定缓冲液。使用制造商规定的有效期内的新鲜甲醛。

• 针对每个组织类型配制 1 ml 固定洗涤缓冲液并置于冰上。

1. 针对每个反应称取 1 mg 新鲜组织。 

2. 将组织样本放入盘中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。

3. 将切碎的组织立即转移到 1 ml 固定缓冲液中，并旋转试管以混合。  

注：此固定溶液体积足以容纳高达 50 mg 的组织。如果处理 ＞50 mg，则相应地增加步骤 3 中使用的固定缓冲液和步骤 7 中使用的固定洗涤缓冲液的量。

4. 室温孵育 2 分钟。

5. 每 1 ml 固定缓冲液中添加 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005 来停止交联。旋转试管以混合并在室温下孵育 5 分钟。

6. 将组织在 4°C下以 2,000 x g 离心 5 分钟，然后移除上清液。

7. 用 1 ml 固定洗涤缓冲液重悬组织。

8. 在 4°C 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟，然后去除上清液并继续执行步骤 9。（安全停止）或者，固定的组织沉淀物在分解前在 -80°C 下可储存长达 6 个月。

9. 将组织重悬在 1 ml 完全洗涤缓冲液中，并将样品转移到 Dounce 匀浆器中。 

10. 用 20-25 冲程将组织块分解成单细胞悬浮液，直到观察不到组织块。

11. 将细胞悬液转移到 1.5 ml 管中，并在室温下以 3,000 x g 的速度离心 3 分钟，从细胞中去除上清液。

12. 在 1 ml 完全洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。

13. 将细胞悬液在室温以 3,000 x g 离心 3 分钟，然后移除上清液。

14. 重复步骤 12 和 13 一次，以再次清洗细胞沉淀物。

15. 针对每个反应，添加 100 µl 完全洗涤缓冲液，并通过柔和上下吹打来重悬细胞沉淀物。

16. 立即进入第 III 部分。

附录 C：测试细胞对洋地黄皂苷的敏感性

在 CUT&Tag 实验步骤中，向缓冲液添加毛地黄皂苷促进了细胞膜透化以及一抗、二抗和 pAG-Tn5 酶进入细胞和胞核。因此，缓冲液中有足量的毛地黄皂苷对抗体与酶成功结合及消化靶向的基因座至关重要。不同细胞系对毛地黄皂苷透化细胞显示不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的洋地黄皂苷量应足以对大多数细胞系或组织进行透化，但您可以使用本实验步骤测试您的特定细胞系或组织。我们发现，添加过量的洋地黄皂苷对本实验没有损害，因此无需生成浓度曲线。所以，进行快速测试以确定建议的洋地黄皂苷量是否适合你的细胞系就足够了。

开始之前：

• 在 90-100°C 下将 Digitonin Solution #16359 加热 5 分钟，并确保完全解冻并溶解。使用过程中，立即将解冻后的 Digitonin Solution #16359 置于冰上。当天完成后，储存在 -20°C 下。

• 配制 100 μl 1X 洗涤缓冲液/反应。无需为这个测试在缓冲液中添加亚精胺或蛋白酶抑制剂。

1. 在 1.5 ml 试管中，采集 100,000 个细胞（来自第 II-A 部分第 1 步），在室温下以 600 x g 的速度离心 3 分钟，并抽取上清液。对于组织，从 1 mg 组织中收集分解的细胞（第 II-B 部分步骤 1-8）。 

2. 在 100 µl 1X 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。

3. 将 2.5 µl 洋地黄皂苷溶液 #16359 添加到每次反应中，并在室温下孵育 10 分钟。

4. 将 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝染料混合。

5. 使用血细胞计数器或细胞计数器计算染色细胞的数量和细胞总数。充分通透会导致 > 90% 的细胞被台盼蓝染色。

6. 如果被台盼蓝染色的细胞不到 90%，则增加每个反应中添加的洋地黄皂苷溶液 #16359 的量，并重复步骤 1-5，直到 > 90% 的细胞被透化和染色。在第 I - V 部分中采用上述洋地黄皂苷溶液 #16359 的量。

附录 D：疑难排解指南