CUT&Tag 解惑答疑指南

选择您正遇到的 CUT&Tag 问题在实验期间，Concanavalin A 珠子会结块 NG-seq 分析中产率低、测序深度低或无信号NG-seq 在未预测的基因组区域显示信号

A. 固定细胞制备

我们强烈建议尽可能使用活细胞。对于某些对伴刀豆球蛋白 A 脆弱或敏感的细胞类型，请在 CUT&Tag 实验之前参考下面的实验步骤略微固定细胞。请注意，细胞固定并不显著增加 CUT&Tag 信号。事实上，过度固定可能导致 CUT&Tag 信号更弱。请参阅 CUT&Tag 实验步骤第 II 部分 的描述，以确定每个反应中适宜的细胞数目。

注：以下试剂为制备固定细胞所需且未包含在 CUT&Tag Assay Kit #77552 中：37% 甲醛液或 16% Formaldehyde Methanol-Free#12606、Glycine Solution (10X)#7005。

在开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应次数按比例缩放。

• 每 1 ml 待处理细胞悬液，配制 2.7 µl 37% 甲醛液或 6.25 µl 16% Formaldehyde, Methanol-Free #12606 并室温保存。使用不超出制造商有效期的新鲜甲醛液。
• 使用前彻底解冻 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287，并且当天用毕时储存于 -20°C。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 配制完全洗涤缓冲液（2 ml 用于每份细胞制备物，额外 100 µl 用于每个 CUT&Tag 反应）并保存于室温。例如，如果同时使用未经处理的细胞和经药物处理的细胞（2 份细胞制备物）并用 4 种抗体测试（阳性对照 H3K4me3 #9751、阴性对照 IgG #2729 或 #68860，以及两种实验性抗体；8 个反应），则将需要总共 4.8 ml 完全洗涤缓冲液。

完全洗涤缓冲液	体积（每份细胞制备物）	体积（每个反应）	总体积
10X 洗涤缓冲液（CUT&RUN、CUT&Tag）#31415	200 μl	10 μl	将两列相加，得出所需的每种试剂总体积。
100X Spermidine #27287	20 μl	1 µl
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012	10 μl	0.5 μl
Nuclease free water #12931	1770 μl	88.5 μl

1. 每个反应收获 100,000 个活细胞。

注：对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶使细胞从培养皿脱离，并用至少 3 体积的组织培养基中和。我们不建议从培养皿刮取细胞，以防细胞裂解。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器准确计数细胞，以确保正确数目的细胞正用于实验。

2. 每 1 ml 细胞悬液添加 2.7 µl 37% 甲醛或 6.25 µl 16% 无甲醇的甲醛 #12606，以实现 0.1% 甲醛终浓度。旋转混匀并置于室温下孵育 2 分钟。
3. 每 1 ml 固定细胞悬液添加 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005 以停止交联。旋转混匀并置于室温下孵育 5 分钟。
4. 将细胞悬液在 4°C 以 3,000 x g 离心 3 分钟并移除上清液。立即进入第 5 步。（安全停止）或者，固定的细胞沉淀物可以在使用前储存于 -80°C 长达 6 个月。

注：如果处理少于 100,000 个总细胞并且离心的细胞沉淀物肉眼不可见，我们不建议冷冻细胞沉淀物。相反，我们建议继续执行该实验步骤并跳过以下洗涤步骤 5 至 7。在步骤 4 中初始离心细胞悬液进行后，移除大部分上清液，留下 ≤40 µl 细胞培养基/反应。然后在步骤 8 中，向细胞悬液中加入足够的完全洗涤缓冲液， 实现总体积 100 µl/反应。

5. 通过柔和上下吹打，在 1 ml 完全洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。
6. 在 4°C 以 3,000 x g 离心 3 分钟，然后移除上清液
7. 重复步骤 5 和 6 一次，以再次清洗细胞沉淀物。
8. 针对每个反应，添加 100 µl 完全洗涤缓冲液，并通过柔和上下吹打来重悬细胞沉淀物。
9. 立即继续执行 CUT&Tag 实验步骤第 III 部分。

B. 固定的组织样品制备

对于大多数组织类型，1 mg 新鲜组织足以产生稳健的组蛋白富集。如果不可获取新鲜组织，可使用略微固定的组织（0.1% 甲醛，2 分钟）。固定的组织样品可以在使用前冷冻于 -80°C 长达 6 个月。过度固定可能导致 CUT&Tag 信号较弱。CUT&Tag 测定法对从组织富集转录因子和辅因子效果不佳。为了分析转录因子和辅因子，我们建议使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。

注：固定组织制备需要以下试剂，不包括在此试剂盒中：37% 甲醛或 16% 无甲醇的甲醛 #12606、磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872 和甘氨酸溶液 (10X) #7005。

在开始之前：

! 所有缓冲液体积都应根据正在进行的 CUT&Tag 反应数目按比例增加。

• 每 1 ml 待处理细胞悬液，配制 2.7 µl 37% 甲醛液或 6.25 µl 16% Formaldehyde, Methanol-Free #12606 并室温保存。使用在制造商标示的有效期内的新鲜甲醛。
• 每 1 ml 固定缓冲液制备 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005。
• 使用前彻底解冻 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287，并且当天用毕时储存于 -20°C。请注意，由于含有 DMSO，Protease Inhibitor Cocktail #7012 置于冰上时会重新冻结。
• 配制完全洗涤缓冲液（3 ml 用于每个组织类型，额外 100µl 用于每个反应 ）并保存于室温，以最大限度减少细胞应激。

完全洗涤缓冲液	体积（每份细胞制备物）	体积（每个反应）	总体积
10X 洗涤缓冲液（CUT&RUN、CUT&Tag）#31415	300 μl	10 μl	将两列相加，得出所需的每种试剂总体积。
100X Spermidine #27287	30 μl	1 µl
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012	15 μl	0.5 μl
Nuclease free water #12931	2655 μl	88.5 μl

• 针对每个组织类型配制 1 ml 固定缓冲液。使用在制造商标示的有效期内的新鲜甲醛。

固定缓冲液	体积（每个组织类型）
甲醛	2.7 µl 37% 或 6.25 µl 16%
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012	5 μl
磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872	992.3 μl

• 针对每个组织类型配制 1 ml 固定洗涤缓冲液并置于冰上。

固定洗涤缓冲液	体积（每个组织类型）
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012	5 μl
磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872	995 μl

1. 针对每个反应称取 1 mg 新鲜组织。
2. 将组织样本放入盘中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
3. 将切碎的组织立即转移到 1 ml 固定缓冲液中，并旋转试管以混合。

注：此体积的固定溶液足以容纳多达 50 mg 的组织。如果处理 >50 mg，则相应地放大步骤 3 中所用固定缓冲液和步骤 7 中所用固定洗涤缓冲液的量。

4. 室温孵育 2 分钟。
5. 通过添加 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005 /1 ml 固定缓冲液终止交联。旋转混匀并置于室温下孵育 5 分钟。
6. 将组织在 4°C下以 2,000 x g 离心 5 分钟，然后移除上清液。
7. 用 1 ml 固定洗涤缓冲液重悬组织。
8. 在 4°C 以 2,000 x g 离心 5 分钟，然后移除上清液，继续步骤 9。（安全停止） 或者，固定的组织沉淀物可以在解离前储存于 -80°C 长达 6 个月。
9. 将组织重悬在 1 ml 完全洗涤缓冲液中，并将样品转移到 Dounce 匀浆器中。
10. 用 20-25 冲程将组织块分解成单细胞悬浮液，直到观察不到组织块。
11. 将细胞悬液转移到 1.5 ml 管中，并在室温下以 3,000 x g 的速度离心 3 分钟，从细胞中去除上清液。
12. 在 1 ml 完全洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。
13. 将细胞悬液在室温以 3,000 x g 离心 3 分钟，然后移除上清液。
14. 重复步骤 12 和 13 一次，以再次清洗细胞沉淀物。
15. 针对每个反应，添加 100 µl 完全洗涤缓冲液，并通过柔和上下吹打来重悬细胞沉淀物。
16. 立即继续执行 CUT&Tag 实验步骤第 III 部分。

C. 确定细胞对毛地黄皂苷的敏感性

在 CUT&Tag 实验步骤中，向缓冲液添加毛地黄皂苷促进了细胞膜透化以及一抗、二抗和 pAG-Tn5 酶进入细胞和胞核。因此，缓冲液中有足量的毛地黄皂苷对抗体与酶成功结合及消化靶向的基因座至关重要。不同细胞系对毛地黄皂苷透化细胞显示不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的洋地黄皂苷量应足以对大多数细胞系或组织进行透化，但您可以使用本实验步骤测试您的特定细胞系或组织。我们发现，添加过量的洋地黄皂苷对本实验没有损害，因此无需生成浓度曲线。所以，进行快速测试以确定建议的洋地黄皂苷量是否适合你的细胞系就足够了。

在开始之前：

• 将毛地黄皂苷溶液 #16359 在 90-100°C 加温 5 分钟，并确保其完全解冻并处于溶液中。使用期间，立即将解冻的毛地黄皂苷溶液 #16359 置于冰上。当天用毕时，储存于 -20°C。
• 配制 100 μl 1X 洗涤缓冲液/反应。无需为这个测试在缓冲液中添加亚精胺或蛋白酶抑制剂。

1X 洗涤缓冲液	体积（每个反应）
10X 洗涤缓冲液（CUT&RUN、CUT&Tag）#31415	10 μl
Nuclease-free Water #12931	90 μl

1. 在 1.5 ml 管中，收集 100,000 细胞（来自 CUT&Tag 实验步骤第 II-A 部分，步骤 1），在室温以 600 x g 离心 3 分钟，并抽回上清液。对于组织，从 1 mg 组织收集解离的细胞（来自CUT&Tag 实验步骤第 II-B 部分，步骤 1-8）。
2. 在 100 µl 1X 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。
3. 将 2.5 µl 洋地黄皂苷溶液 #16359 添加到每个反应中，并在室温下孵育 10 分钟。
4. 将 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝染料混合。
5. 使用血细胞计数器或细胞计数器计算染色细胞的数量和细胞总数。充分透化导致 > 90% 的细胞着染台盼蓝。
6. 如果不到 90%的细胞着染台盼蓝，则增加添加到每个反应的毛地黄皂苷溶液 #16359 的量，并重复步骤 1-5，直到 > 90% 的细胞透化并着染。在 CUT&Tag 实验步骤第 I - V 部分中采用这个量的毛地黄皂苷溶液 #16359。

D. 疑难排解指南

问题	可能的原因	建议
1. 在实验期间，Concanavalin A 珠子会结块。	某些珠子结块为正常，并且通常不危害测定法。	轻轻上下吹打来重悬结块的珠子。将试管静置于试管架上，而不是摇动或转动样品管，可能有助于最大程度减少珠子在管壁上结块和干燥。
	室温孵育珠子和细胞的时间过长。	在 4°C 激活伴刀豆球蛋白 A 珠子，并且与细胞孵育不超过 5 分钟（CUT&Tag 实验步骤第 III 部分，步骤 2）。
	细胞在制备期间裂解。	确保在室温及尽快制备活细胞，以最大程度减少细胞应激（CUT&Tag 实验步骤第 II 部分）。
	洋地黄皂苷浓度可能太高。	一些细胞可能对洋地黄皂苷更敏感，且在更高浓度下裂解。减少毛地黄皂苷的量到足以透化细胞的水平（参见 CUT&Tag 实验步骤附录 A）。
2. NG-seq 分析中产率低、测序深度低或无信号。	在制备期间，细胞计数不准确、细胞损失或裂解。	起始细胞培养应为 60-90% 融合度且看起来健康 (> 90% 活细胞）。确保使用自动细胞计数器或血细胞计数器获得准确的细胞计数。
		切勿用胰蛋白酶处理细胞超过所需的时间，因为这可能干扰 ConA 珠子结合。
		确保在室温下尽快制备细胞，以最大程度地减少细胞应激。
		在一个小瓶中执行初始细胞洗涤步骤，以最大程度减少细胞损失（CUT&Tag 实验步骤第 II 部分）。
	细胞过度固定。	我们建议尽可能使用活细胞或新鲜组织进行 CUT&Tag 测定。如果活细胞或新鲜组织不可获得，我们建议在 0.1% 甲醛中略微固定细胞/组织 2 分钟。过度固定可能导致抑制标签化反应和信号丢失。
	使用的细胞过少。	每次反应尽可能使用 100,000 个细胞。组蛋白修饰可以与少至 5,000 个细胞起作用，而转录因子和辅因子可以与少至 20,000 个细胞起作用。然而，获得良好富集所需的细胞数目高度依赖于靶蛋白的丰度和抗体的亲合力。如果使用少于 100,000 个细胞时未观察到富集，则增加每个反应的细胞数目。每次反应尽可能使用 100,000 个细胞。
	如果从低细胞数目开始，则伴刀豆球蛋白 A 珠结合反应中细胞培养基过多。	在伴刀豆球蛋白 A 珠结合期间，反应中细胞培养基超过 40% 减少了细胞与珠胞结合并导致细胞损失。旋转细胞悬浮液以去除培养基，使每个反应少于 40 µl。然后将完全洗涤缓冲液添加到总共 100 µl 反应中，以便伴刀豆球蛋白 A 珠最佳结合。
	组织样本没有完全分解。	将组织样品解离成单细胞悬液，其中观察不到组织块。对于难以完全解离的纤维组织类型，使用更多起始量的组织补偿组织解离期间的细胞损失。
	洋地黄皂苷不能有效使细胞通透。	确保毛地黄皂苷溶液 #16359 在使用前完全解冻并处于溶液中。有时，毛地黄皂苷在冰上放置数小时后从溶液析出。
		确保测试并确认使用的毛地黄皂苷量足以透化您的特定细胞系（参见 CUT&Tag 实验步骤附录 C）。
		使用时将毛地黄皂苷溶液 #16359 置于冰上，并且当天用毕时储存于 -20°C。不使用时，毛地黄皂苷溶液必须储存于 -20°C。
	pAG-Tn5 酶在测定法中一直未正常起作用。	pAG-Tn5 的保质期为 6 个月。请勿使用过期的 pAG-Tn5。
		pAG-Tn5 活性需要 Mg2+ 二价阳离子。确保在标签化缓冲液中添加适量的氯化镁以激活酶（CUT&Tag 实验步骤第 V 部分，步骤 12）。
		确保向每个 CUT&Tag 反应添加足够的 pAG-Tn5 (2 µl) 并在 37°C 孵育 1 小时，以引起染色质充分标签化（CUT&Tag 实验步骤第 V 部分，步骤 13）。
	抗体在 CUT&Tag 测定法中未起作用。	并非所有抗体都在 CUT&Tag 中起作用，尤其针对非组蛋白靶标的抗体。如可能，使用经 CUT&Tag 验证的抗体。
		确保纳入 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 作为阳性对照，以确认整个实验有效。
	文库制备期间未使用足够的 PCR 循环。	根据每个反应的起始细胞数，使用 13-16 个PCR 循环来扩增标签化的 DNA。请参见 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415的实验步骤 。
3. NG-seq 在未预测到的基因组区域显示信号。	非特异性 pAG-Tn5 标签化遍及整个基因组发生。	请勿过度稀释标签反应期间使用的 10X 高盐毛地黄皂苷缓冲液（CUT&Tag 实验步骤第 V 部分，步骤 12）。高盐浓度对于防止 pAG-Tn5 与开放染色质区域非特异性结合至关重要。
		使用经 CUT&Tag 验证的抗体引导 pAG-Tn5 至特异性基因座。
		请勿在一个反应中使用使用过度起始量的细胞或组织。
		如采用 ATAC-seq 测定法时所见，非特异性 pAG-Tn5 结合导致开放染色质的富集增加。富集开放基因启动子和活跃基因启动子的阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 显示与 ATAC-seq 富集作用显著重叠。靶标特异性抗体富集作用与三甲基组蛋白 H3 抗体富集作用的比较可用于确定非特异性 pAG-Tn5 结合和标签化的程度。