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蛋白质印迹法实验步骤（荧光）

注：TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit (#40683) 含有封闭膜和稀释一抗和二抗所必需的缓冲液。

注：双色蛋白质印迹法需要不同物种的一抗和标记有不同染料的二抗。表位重叠可能造成干扰，因而应当在双色蛋白质印迹法中加以考虑。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液，则在两种缓冲液中分别对每种一抗进行检验，以确定最适合进行双重标记实验的缓冲液。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 配制 1 L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 配制 1 L 1X TBS：添加 100 ml 10X TBS 至 900 ml dH2O 中，混匀。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液。用 dH2O稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 配制 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中，混匀。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 配制 1 L 1X 转移缓冲液：添加 100 ml 10X 转移缓冲液至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，混匀。
  6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X)：(#9997) 制备 1 L 1X TBST：加 100 ml 的 10X TBST 到 900 ml 的 dH2O 中，混匀。
  7. 洗涤缓冲液：1X TBST。
  8. TrueBlack® WB Blocking Buffer：(#57443) 即用型溶液。
  9. TrueBlack® WB Antibody Diluent：(#78710) 即用型溶液。（二抗；anti-rabbit #5151  和  #5366；anti-mouse #5257  和  #5470）。
  10. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)。
  11. 印迹膜和纸：(#12369) 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化（推荐）。通常推荐孔径0.2 µm的膜。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 使用含有调节因子的新鲜培养基对细胞进行一段时间的处理。
  2. 从培养物中吸出培养基；使用冷的 1X PBS 洗涤细胞；吸取。
  3. 加入1X SDS 样本缓冲液（6孔板每孔100 µl或直径10 cm 板每板500 µl）裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声裂解10–15秒，完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样本粘度）。
  5. 加热20 µl 样本至95–100°C 5分钟；在冰上冷却。
  6. 用微量离心机离心 5 分钟。

  7. 上样20µl至 SDS-PAGE 凝胶(10 cm x 10 cm)。

    注：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样以验证电转移和确定分子量。预染标准品在近红外波长范围内具有自发荧光。

  8. 电转移至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；针对不同尺寸的膜，请对体积作出相应调整。

  1. （可选）转移后，在室温用 25 ml TBS 冲洗硝酸纤维素膜 5 分钟。

  2. 将 TrueBlack® WB Blocking Buffer 加热至室温，并在使用前充分混匀。

    注：TrueBlack® WB Blocking Buffer 可能有少量沉淀物，但这不会影响性能。

  3. 在室温下用 10 ml TrueBlack® WB Blocking Buffer 将膜孵育 45 分钟。
  4. 去除 TrueBlack® WB Blocking Buffer。
  5. 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释比例配制）置于 10 ml TrueBlack® WB Antibody Diluent 中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  6. 用 15 ml TBST 洗涤五次，每次 10 分钟。
  7. 将膜与荧光素偶联的二抗（#5470、#5257、#5366、#5151）（1 mg/ml 原液按 1:5000–1:25,000 稀释）在室温下于 10 ml TrueBlack® WB Antibody Diluent 中避光孵育 2 小时，并轻轻搅动。
  8. 在避光条件下，用 15 ml TBST 洗涤五次，每次 10 分钟。

D. 蛋白质检测

  1. 将膜上多余的 TBST 沥干，可使其干燥。

    关键步骤：对于荧光染色，必须确保膜干燥。

  2. 请使用合适的荧光扫描仪并根据制造商的建议扫描膜。