Multiplex Oligos for Illumina Protocol (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN)

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种可以在染色质免疫沉淀 (ChIP) 及核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并定量靶标 DNA 富集情况的高通量方法。Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) 含有非常适合在 Illumina 平台 (Illumina, Inc.) 上针对 NG-seq 制备复用样品的接头和引物。这种试剂盒可以用于生成可并入单个测序反应中多达96 个不同的条形码化 ChIP-seq 或 CUT&RUN DNA 文库。

每种试剂盒组分都必须符合严苛的质量控制标准，并且对于每个新批次，都通过在 Illumina 测序平台上构建索引化文库并对其测序来功能性验证整套试剂。

本产品含有足以支持多达 96 个 DNA 测序文库的试剂，并且必须与 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 联合使用。

兼容的上游检测试剂盒：

• CUT&RUN Assay Kit #86652
• SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
• SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
• SimpleChIP^® Plus Sonication Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #56383

不兼容的上游检测试剂盒：

注：琼脂糖珠被超声处理的鲑鱼精子 DNA 封闭，这将污染 DNA 库制备和 NG-seq。

• SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
• SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004

构建 DNA 库所需的其他产品：

• DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795

所需的试剂：
包括的试剂：

1. •（红色）Adaptor for Illumina #42436
2. •（红色）USER Enzyme #59713
3. º（白色）Index 501 Primer for Illumina #86676
4. º（白色）Index 502 Primer for Illumina #92596
5. º（白色）Index 503 Primer for Illumina #29576
6. º（白色）Index 504 Primer for Illumina #46325
7. º（白色）Index 505 Primer for Illumina #67343
8. º（白色）Index 506 Primer for Illumina #89663
9. º（白色）Index 507 Primer for Illumina #27649
10. º（白色）Index 508 Primer for Illumina #40566
11. •（橙色）Index 701 Primer for Illumina #60797
12. •（橙色）Index 702 Primer for Illumina #79999
13. •（橙色）Index 703 Primer for Illumina #18697
14. •（橙色）Index 704 Primer for Illumina #26125
15. •（橙色）Index 705 Primer for Illumina #39467
16. •（橙色）Index 706 Primer for Illumina #51808
17. •（橙色）Index 707 Primer for Illumina #58724
18. •（橙色）Index 708 Primer for Illumina #65787
19. •（橙色）Index 709 Primer for Illumina #75272
20. •（橙色）Index 710 Primer for Illumina #99422
21. •（橙色）Index 711 Primer for Illumina #10812
22. •（橙色）Index 712 Primer for Illumina #38569
23. Index Primer Orange Tube Caps #54631
24. Index Primer White Tube Caps #70942

未包括的试剂：

1. 适用于 ChIP 或 CUT&RUN Illumina 文库制备的酶和缓冲液：在 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 中提供
2. Nuclease-free Water #12931
3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
4. 新鲜制备的 80% 乙醇
5. 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）
6. 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）
7. Magnetic Separation Rack
8. Bioanalyzer 和 Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.) PCR 试管和 PCR

用于 Illumina（双重索引引物）(ChIP-seq, CUT&RUN) 实验步骤的 Multiplex Oligos

I. 简单的合并指南：

双索引引物策略利用每个引物内的两个 8 碱基索引。Index 7 引物包含 P7 序列周围的索引，而 index 5 引物则包含 P5 序列周围的索引。对序列待测的样品的两端添加特殊索引，即可实现双索引。将 12 index 7 引物的一端与 8 index 5 引物的一端结合在一起，便可为多达 96 种不同样品建立特殊索引。

Illumina NG-seq 平台使用红色激光/LED 对 A/C 测序，并使用绿色激光/LED 对 G/T 测序。对于每个周期，需要读取红色和绿色通道，以确保获得正确的图像配准（即 A 或 C 必须存在于每个周期中，且 G 或 T 也必须存在于每个周期中）。如果未保持色彩平衡，则该索引读数测序可能会无效。请检查每个要使用的索引的序列，以确保每个周期的红色和绿色通道中都有信号。请参见以下示例：

以下表格列出了一些（但不是全部）可一起进行测序的有效索引组合：

另一些其他有效组合如下文所列。选择一组有效的索引 7 引物和一组有效的索引 5 引物。每个索引 7 引物和每个 i5 引物一同使用，形成所需数量的引物对，从而为获得所需 DNA 库数而进行 PCR 扩增。

II. Index 5 Primers for Illumina：

每份 Index 5 Primer for Illumina 在体积 60 µl 中提供。

其中 -s- 表示硫代磷酸键。

III. Index 7 Primers for Illumina：

每份 Index 7 Primer for Illumina 在体积 40 µl 中提供。

其中 -s- 表示硫代磷酸键。

IV. 设置 PCR 反应

1. 确保使用的 index 7 和 index 5 引物组合有效。请参见第一和第二部分，验证是否选择了正确的引物组合。
2. 每根 PCR 试管仅添加一份 Index 5引物 (º) (5 µl) 和 Index 7引物 (•) (5 µl)。更换试管之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。如有必要，丢弃原装的 Index 5 白色盖或 Index 7 橙色盖，并用新盖以避免索引交叉污染。
3. 记录添加到每根 PCR 试管的 Index 5 和 Index 7 引物。
4. 向含有引物的每根试管添加 25 µl Q5 PCR Master Mix (•)。
5. 往相应试管添加 15 µl 接头蛋白连接的 DNA，直至最终容量为 50 µl。轻轻上下摇晃 5–10 次以混匀。更换样品之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。
6. 记录添加到每根 PCR 试管的接头蛋白连接的 DNA 样品。
7. 根据推荐的循环条件快速离心并执行 PCR（请参阅 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 中用于 ChIP-DNA 起始样品或 CUT&RUN DNA 起始样品的相应实验步骤）。

附录：试剂盒组分的质量控制

Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中诸组分借助下文所列的功能检测逐一验证，并且必须符合严苛的质量控制标准。此外，每套组分都通过在 Illumina 测序平台上构建索引化文库并对其测序来加以功能性验证。

I. Adaptor for Illumina (15 µM) (•)

5´-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/ideoxyU/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C-s-T-3´

质量控制检测

1. 16 小时孵育：在 50 μl 反应体积中加入这种接头蛋白和 1 µg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 µl 反应体积中加入 1X 浓度的反应缓冲液和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入至少 5 μl 这种接头蛋白和 1 μg φX174 RF 1 DNA，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
3. 磷酸酶活性：将含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（1 M 二乙醇胺，pH 9.8 和 0.5 mM MgCl₂）中最低 10 μl 的这种适配体在 37°C 孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有对硝基苯阴离子。
4. 核糖核酸酶活性：将这种接头蛋白和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。

II. USER Enyzme (•)

保存在：50 mM KCl、5 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C)、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、175 µg/ml BSA 和 50% 甘油中

质量控制检测

1. 非特异性 DNase 活性（16 小时）：在 50 µl 反应体积中加入 1 µg λ DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。在 50 µl 反应体积中加入 1 µg λ HindIII DNA 和至少 25 个单位的 Endonuclease VIII，并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。
2. 核酸外切酶活性（放射活性释放）：在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 单双链 [³H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 4 小时，最终释放的放射活性小于 0.1% 的总放射活性。在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 单双链 [³H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 10 个单位的 Endonuclease VIII，并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 4 小时，最终放射活性小于 0.5% 的总放射活性。
3. 核酸内切酶活性（带切口）：在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 超螺旋 φX174 DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 UDG Reaction Buffer 孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳测定带切口形式的转化率低于 10%。
4. 磷酸酶活性：如通过 405 nm 处分光光度分析确定，在 37°C 于含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（pH 9.8 的 1 M 二乙醇胺和 0.5 mM MgCl₂）中孵育最低 10 μl 1X 浓度 USER 4 小时未产生可检出的对硝基苯阴离子。

III. Index 5 and Index 7 Primers for Illumina (10 µM) (º•)

质量控制检测

1. 16 小时孵育：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，在含 1 µl Index [X] Primer for Illumina 和 1 μg HindIII 已消化 λ DNA 的 50 μl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的非特异性核酸酶降解。如通过琼脂糖凝胶电泳确定，在含 Index [X] Primer for Illumina 和 1 μg T3 DNA 的 50 μl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的非特异性核酸酶降解。
2. 核酸内切酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 µl Index [X] Primer for Illumina 和 1 μg φX174 RF I 超螺旋化 DNA 的 50 μl 反应在 37°C 孵育 4 小时导致向 RF II（带切口的分子）转化低于 10 %。
3. 核糖核酸酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 µl Index [X] Primer for Illumina 和 40 ng RNA 转录物的 10 µl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的 RNA 降解。
4. 磷酸酶活性：如通过 405 nm 处分光光度分析确定，在 37°C 于含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（pH 9.8 的 1 M 二乙醇胺和 0.5 mM MgCl₂）中孵育 Index [X] Primer for Illumina 4 小时未产生可检出的对硝基苯阴离子。