Multiplex Oligos for Illumina Protocol (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN)

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种可以在染色质免疫沉淀 (ChIP) 及核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并定量靶标 DNA 富集情况的高通量方法。Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) 含有接头和引物，适合在 Illumina Systems 平台 (Illumina, Inc.) 上针对 NG-seq 进行多重样本的制备。这种试剂盒可以用于生成可并入单个测序反应中多达 96 个不同的条形码化 ChIP-seq 或 CUT&RUN DNA 文库。

每一个试剂盒组分均进行严格的质控，并且对于每一个新批次，都在 Illumina Systems 测序平台上通过构建和测序带有索引的文库来对整套试剂进行功能性验证。

本产品提供足以制备多达 96 个 DNA 测序文库的试剂，并且必须与 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 联合使用。

兼容的检测试剂盒：
CUT&RUN Assay Kit #86652
SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
SimpleChIP^® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795
CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647

不兼容的检测试剂盒：
CUT&Tag Assay Kit #77552
SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
注：琼脂糖微珠被超声处理的鲑鱼精子 DNA 封闭，这将污染 DNA 库制备和 NG-seq。

所需的试剂：
包括的试剂：

1. • （红色）Adaptor for Illumina Systems #42436
2. •（红色）USER Enzyme #59713
3. º（白色）Index 501 Primer for Illumina Systems #86676
4. º（白色）Index 502 Primer for Illumina Systems #92596
5. º（白色）Index 503 Primer for Illumina Systems #29576
6. º（白色）Index 504 Primer for Illumina Systems #46325
7. º（白色）Index 505 Primer for Illumina Systems #67343
8. º（白色）Index 506 Primer for Illumina Systems #89663
9. º（白色）Index 507 Primer for Illumina Systems #27649
10. º（白色）Index 508 Primer for Illumina Systems #40566
11. •（橙色）Index 701 Primer for Illumina Systems #60797
12. •（橙色）Index 702 Primer for Illumina Systems #79999
13. •（橙色）Index 703 Primer for Illumina Systems #18697
14. •（橙色）Index 704 Primer for Illumina Systems #26125
15. •（橙色）Index 705 Primer for Illumina Systems #39467
16. •（橙色）Index 706 Primer for Illumina Systems #51808
17. •（橙色）Index 707 Primer for Illumina Systems #58724
18. •（橙色）Index 708 Primer for Illumina Systems #65787
19. •（橙色）Index 709 Primer for Illumina Systems #75272
20. •（橙色）Index 710 Primer for Illumina Systems #99422
21. •（橙色）Index 711 Primer for Illumina Systems #10812
22. •（橙色）Index 712 Primer for Illumina Systems #38569
23. Index Primer Orange Tube Caps #54631
24. Index Primer White Tube Caps #70942

未包括的试剂：

1. 适用于 ChIP 或 CUT&RUN Illumina Systems 文库制备的酶和缓冲液：在 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 中提供
2. Nuclease-free Water #12931
3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
4. 新鲜制备的 80% 乙醇
5. 1X TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)
6. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
7. Magnetic Separation Rack
8. Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation 系统 (Agilent Technologies, Inc.)
9. PCR 试管和 PCR 仪器

一、简单的合并指南：

双索引引物策略利用每个引物内的两个 8 碱基索引。Index 7 引物包含 P7 序列周围的索引，而 index 5 引物则包含 P5 序列周围的索引。对序列待测的样品的两端添加特殊索引，即可实现双索引。将 12 index 7 引物的一端与 8 index 5 引物的一端结合在一起，便可为多达 96 种不同样品建立特殊索引。

Illumina Systems NG-seq 平台使用红色激光/LED 给 A/C 测序，并使用绿色激光/LED 给 G/T 测序。对于每个周期，需要读取红色和绿色通道，以确保获得正确的图像配准（即 A 或 C 必须存在于每个周期中，且 G 或 T 也必须存在于每个周期中）。如果未保持色彩平衡，则该索引读数测序可能会无效。请检查每个要使用的索引的序列，以确保每个周期的红色和绿色通道中都有信号。请参见以下示例：

Index 7 Primers for Illumina Systems		Index 5 Primers for Illumina Systems
Index 701 Primer for Illumina Systems	ATTACTCG	Index 503 Primer for Illumina Systems	CCTATCCT
Index 702 Primer for Illumina Systems	TCCGGAGA	Index 504 Primer for Illumina Systems	GGCTCTGA
Index 703 Primer for Illumina Systems	CGCTCATT	Index 505 Primer for Illumina Systems	AGGCGAAG
Index 704 Primer for Illumina Systems	GAGATTCC	Index 506 Primer for Illumina Systems	TAATCTTA
	✔✔✔✔✔✔✔✔		✔✔✔✔✔✔✔✔

Index 7 Primers for Illumina Systems			Index 5 Primers for Illumina Systems
Index 701 Primer for Illumina Systems	ATTACTCG	Index 502 Primer for Illumina Systems		ATAGAGGC
Index 702 Primer for Illumina Systems	TCCGGAGA	Index 504 Primer for Illumina Systems		GGCTCTGA
Index 703 Primer for Illumina Systems	CGCTCATT	Index 506 Primer for Illumina Systems		TAATCTTA
Index 704 Primer for Illumina Systems	GAGATTCC	Index 508 Primer for Illumina Systems		GTACTGAC
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以下表格列出了一些（但不是全部）可一起进行测序的有效索引组合：

Plex	Index 7 primers for Illumina Systems	Index 5 Primers for Illumina Systems
2	Index 701 和 Index 702 Index 703 和 Index 704 Index 705 和 Index 706 Index 707 和 Index 708 Index 709 和 Index 710 Index 711 和 Index 712	任何 Index 5 引物
3	Index 701、Index 702 和 Index 703 Index 703、Index 704 和 Index 705 Index 705、Index 706 和 Index 707 Index 707、Index 708 和 Index 709 Index 709、Index 710 和 Index 711	任何 Index 5 引物
4	Index 701、Index 702、Index 703 和 Index 704 Index 703、Index 704、Index 705 和 Index 706 Index 705、Index 706、Index 707 和 Index 708 Index 707、Index 708、Index 709 和 Index 710 Index 709、Index 710、Index 711 和 Index 712	任何 Index 5 引物
5-12	任何有效的 Index 7 4-plex 与任何其他 i7 引物的组合（根据需要）	任何 Index 5 引物
> 12	任何有效的 Index 7 4-plex 与任何其他 i7 引物的组合（根据需要）	Index 501、Index 502 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 503、Index 504 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 505、Index 506 和任何其他 Index 5 引物 （根据需要） Index 507、Index 508 和任何其他 Index 5 引物（根据需要）

另一些其他有效组合如下文所列。选择一组有效的 Index 7 引物和一组有效的 Index 5 引物。每个 Index 7 引物和每个 Index 5 引物一同使用，形成所需数量的引物对，从而为获得所需文库数而进行 PCR 扩增。

12 样品池	(1) 一组 4 个 Index 7 引物 * 一组 3 个 Index 5 引物 (2) 一组 3 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 (3) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 2 个 Index 5 引物 (4) 一组 12 个 Index 7 引物 * 一组 1 个 Index 5 引物
26 样品池	(1) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 加上任何 Index 7 引物和任何其他两个 Index 5 引物（组 4 除外） (2) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 5 个 Index 5 引物 使用 30 个引物对中的 26 个来扩增 26 个文库

二、Index 5 Primers for Illumina Systems：

每份 Index 5 Primer for Illumina Systems 的体积为 60 µl。

Index 501 Primer for Illumina Systems	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TATAGCCT
Index 502 Primer for Illumina Systems	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATAGAGGCA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ATAGAGGC
Index 503 Primer for Illumina Systems	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTATCCTA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CCTATCCT
Index 504 Primer for Illumina Systems	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTCTGAA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GGCTCTGA
Index 505 Primer for Illumina Systems	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGCGAAGA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	AGGCGAAG
Index 506 Primer for Illumina Systems	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAATCTTAA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TAATCTTA
Index 507 Primer for Illumina Systems	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCAGGACGTA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CAGGACGT
Index 508 Primer for Illumina Systems	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTACTGACA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GTACTGAC

其中 -s- 表示硫代磷酸键。

三、Index 7 Primers for Illumina Systems：

每份 Index 7 Primer for Illumina Systems 的体积为 40 µl。

Index 701 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ATTACTCG
Index 702 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCCGGAGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TCCGGAGA
Index 703 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATGAGCGGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CGCTCATT
Index 704 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAATCTCGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GAGATTCC
Index 705 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGAATGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ATTCAGAA
Index 706 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAATTCGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GAATTCGT
Index 707 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTTCAGGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CTGAAGCT
Index 708 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCATTAGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TAATGCGC
Index 709 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAGCCGGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CGGCTATG
Index 710 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGCGGAGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TCCGCGAA
Index 711 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCGAGAGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TCTCGCGC
Index 712 Primer for Illumina Systems	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATCGCTGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	AGCGATAG

其中 -s- 表示硫代磷酸键。

四、设置 PCR 反应

1. 确保使用的 index 7 和 index 5 引物组合有效。请参见第一和第二部分，验证是否选择了正确的引物组合。
2. 每根 PCR 试管仅添加一份 Index 5 引物 (º) (5 µl) 和 Index 7 引物 (•) (5 µl)。更换试管之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。如有必要，丢弃原装的 Index 5 白色盖或 Index 7 橙色盖，并用新盖以避免索引交叉污染。
3. 记录添加到每根 PCR 试管的 Index 5 和 Index 7 引物。
4. 向含有引物的每根试管添加 25 µl Q5 PCR Master Mix (•)。
5. 往相应试管添加 15 µl 接头连接的 DNA，直至最终容量为 50 µl。轻轻上下吹打 5–10 次以混匀。更换样品之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。
6. 记录添加到每根 PCR 试管的接头连接的 DNA 样品。
7. 根据推荐的循环条件快速离心并执行 PCR（请参阅 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 中用于 ChIP-DNA 起始样品或 CUT&RUN DNA 起始样品的相应实验步骤）。
   

附录：试剂盒组分的质量控制

Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中的组分借助下文所列的功能检测逐一验证，并且必须符合严苛的质量控制标准。此外，每组组分都通过在 Illumina Systems 测序平台上构建和测序有索引的库来进行功能性验证。

一、Adaptor for Illumina Systems (15 µM) (•)

5´´-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/ideoxyU/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C-s-T-3´´

质量控制检测

1. 16 小时的孵育：在50 µl 反应体积中加入这种接头和 1 µg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 µl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 µg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
2. 核酸内切酶活性：在 50 µl 反应体积中加入至少 5 µl 这种接头和 1 µg φX174 RF 1 DNA，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率 < 10%。
3. 磷酸酶活性：将含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（1 M 二乙醇胺@ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl₂）中最低 10 µl 的这种接头在 37°C 孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有对硝基苯阴离子。
4. 核糖核酸酶活性：将这种接头和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。

二、USER 酶 (•)

存放在 50 mM KCl、5 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C)、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、175 µg/ml BSA 和 50% 甘油中

质量控制检测

1. 非特异性 DNase 活性（16 小时）：在 50 µl 反应体积中加入 1 µg λ DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。在 50 µl 反应体积中加入 1 µg λ HindIII DNA 和至少 25 个单位的 Endonuclease VIII，并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。
2. 核酸外切酶活性（放射活性释放）：在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 单双链 [³H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 4 小时，释放 < 0.1% 的总放射活性。在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 单双链 [³H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 10 个单位的 Endonuclease VIII，并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 4 小时，释放 < 0.5% 的总放射活性。
3. 核酸内切酶活性（带切口）：在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 超螺旋 φX174 DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 UDG Reaction Buffer 孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳测定带切口形式的转化率 < 10%。
4. 磷酸酶活性：将含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（1 M 二乙醇胺@ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl₂）中最低 10 µl 1X 浓度 USER 在 37°C 孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有对硝基苯阴离子。

三、Index 5 和 Index 7 Primers for Illumina Systems (10 µM) (º•)

质量控制检测

1. 16 小时的孵育：在 50 µl 反应体积中加入 1 µl Index [X] Primer for Illumina Systems 和 1 µg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 µl 反应体积中加入 Index [X] Primer for Illumina Systems 和 1 µg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
2. 核酸内切酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 µl Index [X] Primer for Illumina Systems 和 1 µg φX174 RF I 超螺旋化 DNA 的 50 µl 反应在 37°C 下孵育 4 小时导致向 RF II（带切口的分子）转化低于 10%。
3. 核糖核酸酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 µl Index [X] Primer for Illumina Systems 和 40 ng RNA 转录物的 10 µl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的 RNA 降解。
4. 磷酸酶活性：如通过 405 nm 处分光光度分析确定，在 37°C 于含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl₂）中孵育 Index [X] Primer for Illumina Systems 4 小时未产生可检出的对硝基苯阴离子。