MNase 对 CUT&RUN input DNA 的消化

输入 DNA 的片段化是与下游 NG 测序兼容所必需的，但对于下游 qPCR 分析则不是必需的。如果没有超声波仪，我们建议使用未片段化的nput DNA 进行 qPCR 分析；然而，input DNA 应使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化，因为未片段化input DNA 的分子量太大而无法使用 DNA 离心柱进行纯化。如果没有超声波仪并且需要进行下游 NG 测序分析，则可以使用 CUT&RUN 正常 IgG 抗体样品作为阴性对照，尽管这并不理想，因为正常的富含 IgG 的样品可能会显示非特异性 DNA 富集。或者，使用 MNase 的input DNA 片段化实验步骤如下所示。

注： CUT&RUN input DNA 消化需要以下试剂，我们的 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 中不包含以下试剂：SimpleChIP^® Enzymatic Cell Lysis Buffers A & B #14282、Micrococcal Nuclease #10011、DTT (Dithiothreitol) #7016、0.5 M EDTA #7011、10% SDS Solution #20533、DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209、和 nuclease-free water #12931。如果不使用我们的 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652，请另外购买以下试剂：Concanavalin A Magnetic Beads and Activation Buffer #93569、Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012、Proteinase K (20 mg/ml) #10012 和 RNAse A (10 mg/ml) #7013。

开始之前：

! 所有缓冲液体积应根据input DNA 样本的数量成比例增加。

• 将 Concanavalin A Bead Activation Buffer 放在冰上。
• 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化。
• 制备 1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12ml dH2O）。确保 DTT 晶体完全溶解。

  (!!) 重要事项：一旦配制在溶液中，将 1 M DTT 置于 -20℃ 下存放。

• 对于每份input样本，制备 1 ml 1X Buffer A (250 µl 4X Buffer A #7006 + 750 µl nuclease-free water #12931 + 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC)，并放置在冰上。
• 对于每份input制备物，制备 1.2 ml 1X Buffer B (300 µl 4X Buffer B #7007 + 900 µl nuclease-free water #12931 + 0.6 µl 1M DTT)，并放置在冰上。

1. 通过轻轻上下吹打小心地重悬 Concanavalin A 磁珠，确保不要将任何磁珠悬浮液溅出试管。将每个input样品的 10 µl 磁珠悬浮液转移到新的 1.5 ml 微量离心管中。

   注： 避免涡旋 Concanavalin A Magnetic Bead 悬液，因为反复涡旋可能会使珠子中的 Concanavalin A 发生转移。

2. 每 10 µl 珠子添加 100 µl Concanavalin A Bead Activation Buffer。上下吸打来轻轻混合珠子。
3. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后移除液体。

   注： 为了避免磁珠丢失，请使用移液枪来移除液体。请勿使用真空设备抽吸。

4. 从磁力架上取下试管。重复步骤 2 和 3 来二次洗涤珠子。
5. 添加一体积的 Concanavalin A Bead Activation Buffer，体积等同于初始的重悬珠子的液体体积（每份样品 10 µl），上下吹打重悬。
6. 将 10 µl 激活的磁珠悬浮液添加到在 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 实验步骤的 I 部分中制备的每个输入样品中。
7. 在室温下旋转孵育样品 5 分钟。

   注： Concanavalin A 磁珠可能会结块或粘附在试管壁上。摇动而不是旋转试管可能有助于缓解这个问题。上下吹打来重悬珠子。

8. 将样品以 100 x g 的速度短暂离心 2 秒，以从管盖上去除细胞：珠子悬浮液。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后取下试管并丢弃液体。
9. 从支架上取下试管。重悬细胞：对于每个input样品，在 1 ml 冰冷的 1X Buffer A + DTT + PIC 中的磁珠悬浮液。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟倒置一次样品。
10. 将样品以 100 x g 的速度短暂离心 2 秒，以从管盖上去除细胞：珠子悬浮液。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后取下试管并丢弃液体。
11. 重悬细胞：对于每个input样品，在 1 ml 冰冷的 1X Buffer B + DTT 中的磁珠悬浮液。重复步骤 10 并在 100 µl 1X Buffer B +DTT 每个input样品中重悬沉淀物。
12. 通过添加 39 µl 1X Buffer B + DTT 来稀释 1 µl Micrococcal Nuclease #10011 1:40。将 0.5 µl 稀释的 Micrococcal Nuclease 添加到每个input样品中，上下拍打混合。在 37°C 下孵育 20 分钟，频繁混合以将 DNA 消化成大约 150 bp 的长度。

    注： 不要保存剩余的稀释 Micrococcal Nuclease 用于后面的实验。Micrococcal Nuclease 在 Buffer B + DTT 中长时间不稳定。

13. 通过为每个input样品添加 10 µl 0.5 M EDTA #7011 来停止消化。
14. 加入 1 µl 10% SDS Solution #20533（0.1% 最终浓度）、2 µl 蛋白酶 K（20 mg/ml）#10012 以及 0.5 µl RNAse A #7013 到每个样本中。涡旋混合。
15. 在 65°C 下孵育样品 2 小时。
16. 孵育后，以 16,000g 的速度旋转样品 2 分钟。
17. 将试管放在磁性架上，直到溶液变清（30 秒到 2 分钟）。
18. 收集上清液并继续使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 实验步骤（使用离心柱进行 DNA 纯化）的 VI-A 部分 以纯化input DNA。

    注： 在 DNA 离心柱纯化过程中，确保向每个input样品添加 550 µl DNA 结合缓冲液，以使每 1 体积样品j加 5 体积的 DNA 结合缓冲液。