MNase 对 CUT&RUN input DNA 的消化

输入 DNA 的片段化是与下游 下一代测序兼容所必需的，但对于下游 qPCR 分析则不是必需的。如果 没有超声波仪，我们建议使用未片段化的输入 DNA 进行 qPCR 分析； 然而，输入 DNA 应使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化， 因为未片段化输入 DNA 的尺寸太大而无法使用 DNA 离心柱进行纯化。 如果没有超声波仪并且需要进行下游下一代测序分析， 则可以使用 CUT&RUN 正常 IgG 抗体样品作为 阴性对照，尽管这并不理想，因为富含 IgG 的正常样品 可能会显示非特异性 DNA 富集。或者，使用 MNase 的输入 DNA 片段化实验步骤如下所示。

注：CUT&RUN 输入 DNA 消化需要以下试剂，这些试剂不包含在我们的 CUT&RUN Assay Kit #86652 或我们的 CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647 中：SimpleChIP^® Enzymatic Cell Lysis Buffers A & B #14282、Micrococcal Nuclease #10011、DTT (Dithiothreitol) #7016、0.5 M EDTA #7011, 10% SDS Solution #20533、DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209 和 Nuclease-free Water #12931。如果未使用我们的 CUT&RUN Assay Kit #86652 或我们的 CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647，请另外单独购买 以下试剂：Concanavalin A Magnetic Beads and Activation Buffer #93569、Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012、Proteinase K (20 mg/mL) #10012 和 RNAse A (10 mg/mL) #7013。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应 根据输入 DNA 样品的数量成比例增加。

注：对于所有孵育步骤，无需通过摇动或旋转来混合样品。只需 将试管 t放在架子上，置于指定温度下即可。混合不会改善检测性能，反而可能导致 珠子聚集，或因其粘附在管壁和管盖上而造成珠子损失。

• 将 Concanavalin A Bead Activation Buffer 放在冰上。
• 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化 。
• 制备 1 M DTT (192.8 mg DTT #7016 + 1.12 mL dH₂O)。确保 DTT 晶体完全溶解。

  !! 重要事项：一旦溶解， 将 1M DTT 置于 -20°C 下存放。

• 对于每份输入样品，制备 1 mL 1X Buffer A (250 µL 4X Buffer A #7006 + 750 µL Nuclease-free Water #12931 + 0.5 µL 1M DTT + 5 µL 200X PIC) 并置于冰上。
• 对于每份输入样品，制备 1.2 mL 1X Buffer B (300 µL 4X Buffer B #7007 + 900 µL Nuclease-free Water #12931 + 0.6 µL 1M DTT) 并置于冰上。

1. 通过轻轻上 下吹打小心地重悬 Concanavalin A 磁珠，确保不要将任何磁珠悬浮液溅出试管。 对于每份输入样品，将 10 µL 珠子悬液转移到一个新的 1.5 mL 微量离心管中。

   注：避免将 Concanavalin A 磁珠 悬液涡旋，因为反复涡旋可能会使 Concanavalin A 从珠子中移位。

2. 每 10 µL 珠子添加 100 µL Concanavalin A 珠子激活缓冲液 。上下吹打来轻轻混合珠子。
3. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后去除液体。

   注：为了避免珠子丢失，请使用移液器来去除液体 。请勿使用真空设备抽吸。

4. 从磁力架上取下试管。重复步骤 2 和 3 来 二次洗涤珠子。
5. 添加与最初添加的珠子悬液体积相等的 Concanavalin A 珠子激活缓冲液（每份样品 10 µL）， 并通过上下吹打重悬。
6. 向在 CUT&RUN Assay Kit #86652 实验步骤或 CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647 实验步骤第二部分中制备的每份输入样品中加入 10 µL 活化珠子悬液。
7. 将样品在室温下孵育 5 分钟。
8. 将样品以 100 × g 的离心力短暂离心 2 秒，以从管盖上 去除细胞珠子悬液。将试管放在磁力架上， 直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后去除并丢弃液体 。
9. 从支架上取下试管。对每份输入样品，在 1 mL 冰冷的 1X Buffer A + DTT + PIC 中重悬细胞珠子悬液。在冰上孵育 10 分钟。
10. 将样品以 100 × g 的离心力短暂离心 2 秒，以从管盖上 去除细胞珠子悬液。将试管放在磁力架上， 直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后去除并丢弃液体 。
11. 对每份输入样品， 在 1 mL 冰冷的 1X Buffer B + DTT 中重悬细胞珠子悬液。重复步骤 10，对于每份输入样品，在 100 µL 1X Buffer B +DTT 中重悬沉淀物。
12. 通过添加 39 µL 1X Buffer B + DTT 来稀释 1 µL Micrococcal Nuclease #10011 1:40 。将 0.5 µL 稀释的 Micrococcal Nuclease 添加到每份 输入样品中，上下吹打混合。在 37°C 下孵育 20 分钟，频繁混合以将 DNA 消化成约 150 bp 的长度。

    注：不要保存剩余的稀释 Micrococcal Nuclease 以供将来实验使用。Micrococcal Nuclease 在 Buffer B + DTT 中 长时间不稳定。

13. 通过为每份输入样品添加 10 µL 0.5 M EDTA #7011 来停止消化。
14. 加入 1 µL 10% SDS Solution #20533（0.1% 最终浓度）、2 µL proteinase K (20 mg/mL) #10012 以及 0.5 µL RNAse A #7013 到每个样品中 。涡旋混合。
15. 在 65°C 下孵育样品 2 小时。
16. 孵育后，以 16,000g 的速度旋转样品 2 分钟。
17. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒到 2 分钟）。
18. 采集上清液， 并继续按照 CUT&RUN Assay Kit #86652 实验步骤第七部分 A 或 CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647 实验步骤第八部分 A （使用离心柱进行 DNA 纯化） 操作，以纯化输入 DNA。

    注：在 DNA 离心柱纯化过程中，确保向每份输入样品添加 550 µL DNA Binding Buffer，以使每 1 体积样品具有 5 体积的 DNA Binding Buffer。