! | ! 表示实验步骤中需要根据进行的 CUT & RUN 反应次数来调整体积的重要步骤。 |
!! | !! 表示需要在操作前稀释缓冲液的一个重要步骤。 |
安全停止 | 如果需要停止,这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
注释: 细胞制备步骤(步骤6-16)应在室温下连续进行,以最大程度减少细胞应激。为了最大限度减少 DNA 碎裂,在重悬过程中应避免剧烈涡旋和气泡产生。
注释: 在本实验步骤中,每次反应使用 100,000 个细胞。但这些相同的反应条件也可适用于每份样品用 10,000 至 250,000 个细胞。
注释: 建议用于细胞通透的洋地黄皂苷的量为过量,应足以满足大多数细胞系的通透。但并非所有细胞系对洋地黄皂苷都显示出相同的敏感性。在您开始实验之前,建议您按照附录 A 中提供的实验步骤来测试您的特定细胞系。洋地黄皂苷处理应使 >90% 的细胞完成通透处理。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注:洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
注:避免涡旋 Concanavalin A Magnetic Bead 悬液,因为反复涡旋可能会使珠子中的 Concanavalin A 发生转移。
注:为了避免珠子丢失,请使用移液枪来移除液体。请勿使用真空设备抽吸。
注:在随后的实验步骤中,将在 55°C 下孵育输入样品,因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
注:Concanavalin A 磁珠可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。
注:CUT&RUN 需要的抗体量会有所不同,应由使用者确定。对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb,向样品中添加 2 µl 抗体。对于阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362,向样品中添加 5 µl。我们强烈建议使用阴性对照抗体,而不是非抗体对照,因为后者会导致高水平的非特异性 MNase 消化和高背景信号。我们建议使用input样品作为 qPCR 和 NG-seq 分析的对照样品。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注:洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注:洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
注:应在 4°C 的温控板上或在冰箱中进行消化。冰的温度可低至 0°C,这可能会限制消化并降低信号。
注:该孵育步骤可以延长到 30 分钟。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。
注:可能需要按照附录 B 中的实验步骤测试不同的超声波仪功率设置和/或超声处理持续时间,以根据经验确定超声处理条件。最佳超声处理条件将产生大小为 100-600 bp 的染色质片段。使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探针的 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/超声波仪以 5 组 15 秒脉冲进行超声处理,可充分碎裂input染色质。
如 A 部分所述,使用 DNA 离心柱可从input和富集染色质样品中纯化 DNA,或如第 B 部分所述,使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行纯化。使用 DNA 离心柱纯化简单快速,可很好地回收 35 bp 以上的 DNA 片段(图 7A,泳道 2)。苯酚/氯仿提取之后再行乙醇沉淀更加困难,但能很好地回收 35 bp 以下的 DNA 片段(图 7A,泳道 3);但如图 7B 所示,大多数在 CUT&RUN 检测中产生的 DNA 片段大于 35 bp。因此,DNA 离心柱提供一种快速简单的方法来纯化 > 98% 的所有 CUT&RUN DNA 片段。
在 NG-seq 分析之前,使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法可以对纯化的 DNA 进行定量。对于含 100,000 个细胞的 CUT&RUN 反应,一次转录因子和辅因子的 CUT&RUN 反应中,预期 DNA 产量为 0.5-10 ng,而在一次组蛋白修饰反应中则为 1-20 ng。
图 7. 比较使用离心柱或苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行的 DNA 纯化。(A) 低量程 DNA 分子量标准(泳道 1,未纯化)使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209(泳道 2)进行纯化,或使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法(泳道 3)进行纯化,并在 4% 琼脂糖凝胶电泳来进行分离。如图所示,苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀能有效回收所有大小的 DNA 片段,而 DNA 离心柱仅能回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 在使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 的 CUT&RUN 检测中使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA。使用一台Bioanalyzer (Agilent Technologies) 分析文库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。因此,文库制备后,起始 35 bp 的 DNA 片段长度将变为 175 bp(图中用蓝色垂直线标注)。如图所示,总 CUT&RUN 富集 DNA 片段中不到 2% 短于 175 bp(起始长度 35 bp),提示 DNA 纯化离心柱足以捕获 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。
注:使用 Cell Signaling® DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209(未包含在本试剂盒中)以及下面修改后的实验步骤从输入样品和富集染色质样品中纯化 DNA。步骤 1-5 已修改,以符合向 300 µl input样品和富集染色质样品中添加 5 倍体积 (1.5 ml) DNA 结合缓冲液的要求。
注:对于每 1 体积样品,应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。
注:苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀需要以下试剂,但不包含在该试剂盒中:苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿/异戊醇 (24:1)、3M 醋酸钠 (pH 5.2)、20mg/ml糖原、100%的乙醇 、70%的乙醇和 1X TE 缓冲液或无核酸酶的水。
注:如果进行样品标准化,仅 CUT&RUN 样品使用 Sample Normalization Primer Set 分析 。input DNA 不包含Normalization Spike-In DNA。
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
---|---|
Nuclease-free H2O #12931 | 6 μl |
5 µM 引物 | 2 μl |
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 | 10 μl |
a. | 初始变性 | 95°C,3 分钟 |
b. | 变性 | 95°C,15 秒钟 |
c. | 退火和延伸 | 60°C,60 秒钟 |
d. | 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。 |
样品标准化引物组的 C[T] 值 | **qPCR 的标准化系数 | 标准化之前的信号(从步骤 5 中计算出的input [%]) | 标准化之后的信号 | |
样品 1 | 23.31 | 2(23.31-23.31)=1.00 | 24.4% | 24.4%/1.00=24.4% |
样品 2 | 24.24 | 2(23.31-24.24)=0.52 | 12.0% | 12.0%/0.52=23.1% |
样品 3 | 25.08 | 2(23.31-25.08)=0.29 | 6.28% | 6.28%/0.29=21.7% |
样品 4 | 26.30 | 2(23.31-26.30)=0.13 | 2.72% | 2.72%/0.13=20.9% |
**qPCR 的标准化系数 = 2(C[T] 选定样品 – C[T] 其他样品)
图 8. 应用添加的Spike-In DNA对 CUT&RUN 信号进行 qPCR 标准化分析。对数量渐减的 HCT116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751(上小图)或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499(下小图)进行 CUT&RUN。使用 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP® Human Β-Actin 3' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为与 100,000 个细胞的input染色质总量相对应的信号。左图中为非标准化的富集结果。在每次反应中,按照与起始细胞数量成比例的方式添加 Sample Normalization Spike-In DNA。根据每份样品中添加 DNA 所产生的 qPCR 信号差异,将 CUT&RUN 信号标准化为含 100,000 个细胞的样品。右图显示了标准化后的富集。
用这种试剂盒制备的免疫富集 DNA 样品直接兼容 NG-seq。要构建下游 NG-seq DNA 文库,请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于在 Illumina® 平台上测序,我们建议使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 和 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® #29580 或 #47538。
与酵母对应的unique reads数 | NGS 的标准化系数 | 标准化之前与测试参考基因组对应的unique reads数 | NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母 reads数/其他样品的酵母unique reads数 | |
样品 1 | 219,275 | 219,275/219,275 = 1.00 | 5,077,747 | 5,077,747 X 1.00 = 5,077,747 |
样品 2 | 411,915 | 219,275/411,915 = 0.53 | 9,896,671 | 9,896,671 X 0.53 = 5,268,306 |
样品 3 | 816,235 | 219,275/816,235 = 0.27 | 17,842,773 | 17,842,773 X 0.27 = 4,793,320 |
样品 4 | 1,120,826 | 219,275/1,120,826 = 0.20 | 23,836,679 | 23,836,679 X 0.20 = 4,663,339 |
NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母unique reads数/其他样品的酵母unique reads数
在 CUT&RUN 实验步骤中,向缓冲液中添加洋地黄皂苷能促进细胞膜透化以及一抗和 pAG-MNase 酶进入细胞和胞核。因此,缓冲液中有足量的洋地黄皂苷对抗体和酶的成功结合以及靶向基因位点的消化至关重要。不同细胞系对洋地黄皂苷细胞透化有不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的洋地黄皂苷量应足以对大多数细胞系进行透化,但我们仍然建议对你的特定细胞系进行初步测试。我们发现,添加过量的洋地黄皂苷对本实验没有损害,因此无需生成浓度曲线。所以,进行快速测试以确定建议的洋地黄皂苷量是否适合你的细胞系就足够了。
注:洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
建议对input DNA 样品进行超声处理,因为 DNA 纯化离心柱只能纯化片段化的基因组 DNA (< 10 kb)。此外,片段化的基因组 DNA (< 1 kb) 可在 NG-seq 分析中用作阴性对照。应优化超声处理,以便input DNA 的长度为 100-600 bp。
我们建议使用input样品进行 NG-seq,因为它能方便且无偏倚的呈现细胞基因组。虽然 IgG 样品也可在 NG-seq 中用作阴性对照,但由于存在非特异性结合,它可能会显示基因组特定区域出现富集。非片段化input DNA 可用于 qPCR 分析。但必须使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化非片段化的 DNA。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。
注:在步骤 9中,在 55 °C 下孵育样品,因此建议使用一个可封盖的 1.5 ml 管子,以减少孵育过程中出现蒸发。
问题 | 可能的原因 | 建议 |
---|---|---|
问题 | 可能的原因 | 建议 |
1. 在实验期间,Concanavalin A 珠子会结块。 | 珠子结块是正常的,并且通常不会影响检测。 | 轻轻上下吹打来重悬结块的珠子。 |
室温孵育珠子和细胞的时间过长。 | 在 4°C 下激活 Concanavalin A 珠子,并且细胞孵育不超过 5 分钟(第 I 部分步骤 14)。 | |
细胞在制备期间裂解。 | 确保在室温下尽快制备细胞,以最大程度地减少细胞应激(第 I 部分步骤 7-16)。 | |
洋地黄皂苷浓度可能太高。 | 一些细胞可能对洋地黄皂苷更敏感,且在更高浓度下裂解。减少检测中的洋地黄皂苷量,但要确认使用的量足以进行细胞透化(见附录 A)。 | |
2. 使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法时,在纯化的 DNA 样品中未检测到 DNA。 | 这通常发生在使用起始数量较少的细胞时(< 10,000 个细胞)起始时,但当使用建议的 100,000 个起始细胞时应能检测到 DNA。 | 确保使用基于picogreen 的 DNA 定量测定法。使用 NanoDrop、Bioanalyzer® 或 Tapestation® 通常无法检测到纯化的 DNA。 |
在制备期间,可能会发生细胞计数下降,细胞丢失或裂解。 | 起始细胞培养应为 60-90% 融合度且看起来健康 (> 90% 活细胞)。 | |
确保在室温下尽快制备细胞,以最大程度地减少细胞应激。 | ||
清洗试管中的所有细胞,以最大程度地减少细胞丢失(第 I 部分步骤 7-16)。 | ||
洋地黄皂苷不能有效使细胞通透。 | 不使用时,确保将洋地黄皂苷溶液保存在 -20°C 下,因为保存在 -20°C 以上时,它不稳定。 | |
确保测试并确认使用的洋地黄皂苷量足以通透您的特定细胞系(见附录 A)。 | ||
pAG-MNase 酶在检测中无法正常工作。 | pAG-MNase 的稳定性很高,并且在妥善保存时应能保持长时间的活性。 | |
pAG-MNase 需要 Ca2+ 二价阳离子才能激活。确保添加氯化钙来激活酶(第 III 部分步骤 8)。 | ||
确保消化 30 分钟,以使酶能充分消化染色质(第 III 部分步骤 9)。 | ||
在反应中未加入足量的抗体,或抗体在 CUT&RUN 实验中不工作。 | 并非所有抗体都可应用于 CUT&RUN 。如可能,使用一种经 CUT&RUN 验证的抗体。或者,一些经 ChIP 和 IF 验证的抗体对 CUT&RUN 也有效。 | |
确保包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb,以证实您的检测是有效的。 | ||
3. qPCR 或 NG-seq 分析中没有信号。 | 查看问题 2 的可能原因。 | 查看问题 2 的建议。 |
消化温度可能太低。 | 我们发现,在冰上(0°C)进行消化可显著降低靶标染色质片段的回收率,从而导致 qPCR 和 NG-seq 信号降低。请确保在 4°C 的控温板上或在冰箱中进行消化。 | |
qPCR 反应中未添加足量的 DNA。 | 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 | |
NG-seq DNA 库制备中未添加足量的 DNA。 | 确保使用一种基于 picogreen 的 DNA 定量测定法来定量纯化的 DNA,并使用建议的起始 DNA 量和 PCR 扩增周期(见第 VII 部分)。 | |
PCR 扩增区域可能横跨无核小体的区域。 | CUT&RUN 检测中生成的 DNA 片段通常比 ChIP 实验中生成的 DNA 片段小。因此,设计引物来生成不长于 60-80 bp 的扩增子至关重要。 | |
4. qPCR 或 NG-seq 分析中的背景信号高。 | 样品处理过度,基因组 DNA 已经被高度碎裂。 | 始终使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 阴性对照抗体来确定 CUT&RUN 检测中的背景信号。 |
为最大限度地减少 DNA 碎裂,避免在细胞再悬浮期间剧烈涡旋和产生气泡。 | ||
由于细胞应激和裂解,基因组 DNA 已被高度碎裂。 | 确保在室温下尽快制备细胞,以最大程度地减少细胞应激。清洗试管中的所有细胞,以最大程度地减少细胞丢失(第 I 部分步骤 7-16)。 | |
消化温度可能太高。 | 应在 4°C 的控温板上或在冰箱中进行消化。在较高温度下消化会显著增强背景信号。 | |
开始消化之前,请确保在冰上将样品和氯化钙预冷。 | ||
非特异性基因组 DNA 大片段还会扩散到上清液中,并且污染由靶向酶解剪切产生的较小片段。 | 请勿在 37°C 下孵育样品超过 10 分钟,也不要在孵育期间摇晃样品(第 III 部分步骤 11)。十分钟足以使被消化的片段扩散到上清液中。 | |
在 qPCR 分析前,使用 AMPure® XP Beads 或 SPRIselect® Reagent Kit 选择大小可以去除基因组 DNA 大片段。 | ||
对于 NG-seq 分析,在文库构建期间缩短 PCR 扩增时间(10-15 秒钟),即可排除 DNA 大片段扩增。 | ||
检测中使用过多抗体,导致非特异性结合和消化。 | 如可能,确保按推荐的稀释度使用一种经 CUT&RUN 验证的抗体。如果没有,经 ChIP 验证和经 IF 验证的抗体在建议的 ChIP 和 IF 稀释度下通常有效。您可能需要在检测中通过滴定实验确定抗体用量。 |
发布于 2019 年 11 月
修订于 2021 年 2 月