CUT&RUN Kit Protocol

I. 细胞制备和一抗结合

注释： 细胞制备步骤（步骤6-16）应在室温下连续进行，以最大程度减少细胞应激。为了最大限度减少 DNA 碎裂，在重悬过程中应避免剧烈涡旋和气泡产生。

注释： 在本实验步骤中，每次反应使用 100,000 个细胞。但这些相同的反应条件也可适用于每份样品用 10,000 至 250,000 个细胞。

注释： 建议用于细胞通透的洋地黄皂苷的量为过量，应足以满足大多数细胞系的通透。但并非所有细胞系对洋地黄皂苷都显示出相同的敏感性。在您开始实验之前，建议您按照附录 A 中提供的实验步骤来测试您的特定细胞系。洋地黄皂苷处理应使 >90% 的细胞完成通透处理。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。

• 取出并温热 200X 蛋白酶抑制剂混合物和 100X 亚精胺。确保两种物质完全融化。
• 取出洋地黄皂苷溶液，并在 90-100°C 下加热 5 分钟，确保完全解冻为溶液。立即将已融化的洋地黄皂苷溶液放在冰上。

  注：洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上，并在实验完成后保存在 -20°C 下。

• 制备 1X 洗涤缓冲液（每种细胞系 2 ml，每个反应或每份input样品额外准备 100 µl）。例如，要制备 2.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 250 µl 10X洗涤缓冲液 + 25 µl 100X 亚精胺 + 12.5 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 + 2212.5 µl 水。让其平衡到室温，以最大程度减少细胞应激。
• 每次反应制备 1 µl 100X 亚精胺 + 0.5 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 + 2.5 µl 洋地黄皂苷溶液 + 96 µl Antibody Binding Buffer，并放在冰上（每次反应 100 µl）。
• 将 Concanavalin A Bead Activation Buffer 放在冰上。

注：避免涡旋 Concanavalin A Magnetic Bead 悬液，因为反复涡旋可能会使珠子中的 Concanavalin A 发生转移。

1. 通过轻轻上下吹打小心地重悬 Concanavalin A 磁珠，确保不要将任何磁珠悬浮液溅出试管。按照每个 CUT&RUN 反应，将 10 µl 珠子悬液转移到一个新的 1.5 ml 微量离心管中。
2. 每 10 µl 珠子添加 100 µl Concanavalin A Bead Activation Buffer。上下吸打来轻轻混合珠子。
3. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后移除液体。

   注：为了避免珠子丢失，请使用移液枪来移除液体。请勿使用真空设备抽吸。

4. 从磁力架上取下试管。重复步骤 2 和 3 来二次洗涤珠子。
5. 添加一体积的 Concanavalin A Bead Activation Buffer，体积等同于初始的重悬珠子的液体体积（每份样品 10 µl），上下吹打重悬。将激活的珠子保存在冰上，直至第 I 部分步骤 13。
6. 在室温下收集新鲜的细胞培养物，以最大程度减少细胞应激。每个抗体/微球菌核酸酶 (MNase) 反应收集 100,000 个细胞，并为input样品额外收集 100,000 个细胞。确保包括用于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control (CUT&RUN) 的反应。
7. 将细胞悬液在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
8. 于室温下用 1 ml 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬细胞沉淀物，并上下轻轻吹打。
9. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
10. 重复步骤 8 和 9 一次，以再次清洗细胞沉淀物。
11. 每 100,000 个细胞添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），并轻轻上下摇晃移液管来重悬细胞沉淀物。
12. 转移 100 µl 细胞到一个新试管中，并保存在 4°C 下，直到第 IV 部分。这是您的input样品。

    注：在随后的实验步骤中，将在 55°C 下孵育输入样品，因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管，以减少孵育过程出现蒸发。

13. 上下吹打来重悬激活的 Concanavalin A 磁珠（来自步骤 5）。每 100,000 个细胞添加 10 µl 激活的珠子悬液到步骤 11 的洗涤后细胞悬液。
14. 在室温下旋转孵育样品 5 分钟。

    注：Concanavalin A 磁珠可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。

15. 以 100 x g 短暂离心分离样品，以移除试管盖上的细胞-珠子悬液。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后取下试管并丢弃液体。
16. 从支架上取下试管。每 100,000 个细胞添加 100 µl 抗体结合缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷），并放在冰上。
17. 按每次反应分装 100 µl 细胞珠子悬液到一根单独的 1.5 ml 试管中，并放在冰上。
18. 按每次反应添加适量抗体，并上下吹打来轻柔混合。

    注：CUT&RUN 需要的抗体量会有所不同，应由使用者确定。对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751，向样品中添加 2 µl 抗体。对于阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control (CUT&RUN) #66362，向样品中添加 5 µl。我们强烈建议使用阴性对照抗体，而不是非抗体对照，因为后者会导致高水平的非特异性 MNase 消化和高背景信号。我们建议使用input样品作为 qPCR 和 NG-seq 分析的对照样品。

19. 在 4°C 下旋转试管 2 小时。该步骤可以延长到过夜。

II. pAG-MNase 酶结合

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。

• 取出洋地黄皂苷溶液，并在 90-100°C 下加热 5 分钟，确保完全解冻为溶液。立即将已融化的洋地黄皂苷溶液放在冰上。

注：洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上，并在实验完成后保存在 -20°C 下。

• 按每次反应制备 1.05 ml 洋地黄皂苷缓冲液（105 µl 10X 洗涤缓冲液 + 10.5 µl 100X 亚精胺 + 5.25 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 + 26.25 µl 洋地黄皂苷溶液 + 903 µl 水）。
• 对于每次反应，向一根新管中添加 50 µl 洋地黄皂苷缓冲液（如上所述）和 1.5 µl pAG-MNase 酶来制备 pAG-MNase 预混合物。例如，对于 10 次反应，转移 500 µl 洋地黄皂苷缓冲液到一根新管中，并添加 15 µl pAG-MNase 酶。轻轻上下吹打以混合，并放在冰上。

1. 以 100 x g 短暂离心分离第 I 部分步骤 19 中的样品，以移除试管盖上的细胞珠子悬液。
2. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后移除液体。
3. 从磁力架上取下试管，添加 1 ml 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷）。轻轻上下吹打重悬珠子。
4. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后移除液体。
5. 从磁力架上取下试管。向每根试管添加 50 µl pAG-MNase 预混合物，并轻轻上下吹打来混合样品。
6. 在 4°C 下旋转试管 1 小时。

III. DNA 消化和释放

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。

• 取出洋地黄皂苷溶液，并在 90-100°C 下加热 5 分钟，确保完全解冻为溶液。立即将已融化的洋地黄皂苷溶液放在冰上。

  注：洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上，并在实验完成后保存在 -20°C 下。

• 每次反应制备 2.15 ml 洋地黄皂苷缓冲液（215 µl 10X 洗涤缓冲液 + 21.5 µl 100X 亚精胺 + 10.75 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 + 53.75 µl 洋地黄皂苷溶液 + 1.849 ml 水）。
• 每次反应制备 150 µl 1X Stop Buffer（37.5 µl 4X Stop Buffer + 3.75 µl 洋地黄皂苷溶液 + 0.75 µl RNAse A + 108 µl 水）。
• 将氯化钙放在冰上。
• 可选：如需对样品进行标准校对，则可将 Sample Normalization Spike-In DNA 添加到 1X Stop Buffer 中（例如，见第六部分的图 ）。对于 qPCR 分析，我们建议每次反应加入 5 µl (5 ng) Spike-In DNA。对于 NG-seq 分析，我们建议用无核酸酶水稀释 Sample Normalization Spike-In DNA 500倍，每次反应加入 5 µl (10 pg) Spike-In DNA。如果您使用整个样品进行测序，这将导致每一百万次总测序读取中有至少一千次标准品样品数据被读取。如果每次反应起始量使用多于或少于 100,000 个细胞，则应按比例增加或减少 Sample Normalization Spike-In DNA 标准品的体积来进行 NG-seq 分析。例如，对于 25,000 个起始细胞，每次反应加入 1.25 µl (2.5 pg) 1:500 稀释的添加 DNA。

注：应在 4°C 的温控板上或在冰箱中进行消化。冰的温度可低至 0°C，这可能会限制消化并降低信号。

1. 以 100 x g 短暂离心分离第 II 部分步骤 6 的样品，以去除试管盖上的细胞珠子悬液。
2. 将试管放在磁分离架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后移除液体。
3. 从磁分离架上取下试管。添加 1 ml 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷），并轻轻上下吹打来重悬珠子。
4. 重复步骤 2 和 3 一次。
5. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后移除液体。
6. 从磁力架上取下试管。往每根试管中添加 150 µl 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷），并轻轻上下摇晃移液管来混合。
7. 将试管在冰上放置 5 分钟，使之在消化反应前冷却。
8. 向每根试管中添加 3 µl 冷却的氯化钙来激活 MNase，并上下吹打混合。
9. 4°C 条件下孵育样本 30 分钟。
10. 向每份样品中添加 150 µl 1X Stop Buffer（+ 洋地黄皂苷 + RNAse A + Spike-in DNA [可选]），并上下吹打来混合。
11. 在 37°C 下孵育试管 10 分钟，不要摇晃，使 DNA 片段进入溶液。

    注：该孵育步骤可以延长到 30 分钟。

12. 以 16,000 x g 在 4°C 下离心分离 2 分钟，然后将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟）。
13. 将上清液转移到一根新的 1.5 ml 微量离心管中，并放在冰上。这是您的富集后的染色质样品。
14. 立即进行第 V 部分（安全停止）。或者，可将样品保存在 -20°C 下，1 周以内。但在 DNA 纯化（第 V 部分）之前，请确保将样品回温到室温。

IV. input样品的制备

! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。

开始之前：

• 取出并加热 DNA 提取缓冲液。确保完全解冻。
• 每份input样品制备 2 µl 蛋白酶 K + 0.5 µl RNAse A + 197.5 µl DNA 的提取缓冲液（每份input样品 200 µl）。

1. 向第 I 部分步骤 12 的 100 µl 细胞悬液中添加 200 µl DNA Extraction Buffer（+ 蛋白酶 K + RNAse A）。上下吹打混合。
2. 将试管放在 55°C 下 1 小时，伴有摇晃。
3. 将试管放在冰上 5 分钟，让样品完全冷却。
4. 对input样品进行超声处理，以裂解细胞并破碎染色质。在两次脉冲之间将样品放在冰上孵育 30 秒钟。

   注：可能需要按照附录 B 中的实验步骤测试不同的超声波仪功率设置和/或超声处理持续时间，以根据经验确定超声处理条件。最佳超声处理条件将产生大小为 100-600 bp 的染色质片段。使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探针的 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/超声波仪以 5 组 15 秒脉冲进行超声处理，可充分碎裂input染色质。

5. 在 4°C 下以 18,500 x g 离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。将上清液转移到一根新的 1.5 ml 微量离心管。
6. 立即进行第 V 部分“DNA 纯化”。（安全停止）或者，可将样品保存在 -20°C 下， 1 周以内。但在 DNA 纯化程序（第 V 部分）之前，确保将样品回温到室温。

V. DNA 纯化

如 A 部分所述，使用 DNA 离心柱可从input和富集染色质样品中纯化 DNA，或如第 B 部分所述，使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行纯化。使用 DNA 离心柱纯化简单快速，可很好地回收 35 bp 以上的 DNA 片段（图 7A，泳道 2）。苯酚/氯仿提取之后再行乙醇沉淀更加困难，但能很好地回收 35 bp 以下的 DNA 片段（图 7A，泳道 3）；但如图 7B 所示，大多数在 CUT&RUN 检测中产生的 DNA 片段大于 35 bp。因此，DNA 离心柱提供一种快速简单的方法来纯化 > 98% 的所有 CUT&RUN DNA 片段。

在 NG-seq 分析之前，使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法可以对纯化的 DNA 进行定量。对于含 100,000 个细胞的 CUT&RUN 反应，一次转录因子和辅因子的 CUT&RUN 反应中，预期 DNA 产量为 0.5-10 ng，而在一次组蛋白修饰反应中则为 1-20 ng。

图 7. 比较使用离心柱或苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行的 DNA 纯化。(A) 低量程 DNA 分子量标准（泳道 1，未纯化）使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209（泳道 2）进行纯化，或使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法（泳道 3）进行纯化，并在 4% 琼脂糖凝胶电泳来进行分离。如图所示，苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀能有效回收所有大小的 DNA 片段，而 DNA 离心柱仅能回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 在使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 的 CUT&RUN 检测中使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA。使用一台Bioanalyzer (Agilent Technologies) 分析文库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。因此，文库制备后，起始 35 bp 的 DNA 片段长度将变为 175 bp（图中用蓝色垂直线标注）。如图所示，总 CUT&RUN 富集 DNA 片段中不到 2% 短于 175 bp（起始长度 35 bp），提示 DNA 纯化离心柱足以捕获 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。

A. 使用离心柱进行 DNA 纯化

注：使用 Cell Signaling^® DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209（未包含在本试剂盒中）以及下面修改后的实验步骤从输入样品和富集染色质样品中纯化 DNA。步骤 1-5 已修改，以符合向 300 µl input样品和富集染色质样品中添加 5 倍体积 (1.5 ml) DNA 结合缓冲液的要求。

在开始之前：

• !! 使用前向 DNA Wash Buffer #10008 中添加 24 ml 乙醇 (96-100%)。此操作仅需在第一次DNA纯化前进行。
• 针对每份需纯化的富集染色质样品或输入样品，取出一个 DNA 纯化收集管 #10010。

1. 向每份input样品和富集染色质样品中添加 1.5 ml DNA 结合缓冲液，并短暂涡旋。

   注：对于每 1 体积样品，应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。

2. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出 600 μl 并将其至收集管的 DNA 离心柱中。
3. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。将离心柱放回空的收集管。
5. 重复步骤 2-4，直到步骤 1 中的整个样品已经过离心柱旋转。将离心柱放回空的收集管。
6. 向收集管的离心柱添加 750 μl DNA Wash Buffer。
7. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。将离心柱放回空的收集管。
9. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
11. 向每根离心柱添加 50 μl DNA 洗脱缓冲液，并放在干净的 1.5 ml 管中。
12. 用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心分离 30 秒，以洗脱 DNA。
13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。（安全停止）样本在 -20°C 下最多保存 6 个月。

B. 使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀方法进行 DNA 纯化

注：苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀需要以下试剂，但不包含在该试剂盒中：苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿/异戊醇 (24:1)、3M 醋酸钠 (pH 5.2)、20mg/ml糖原、100％的乙醇 、70％的乙醇和 1X TE 缓冲液或无核酸酶的水。

1. 向每份input样品和富集染色质样品中添加 300 µl 苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)，并涡旋 30 秒钟充分混合。
2. 使用微量离心机以 16,000 x g 的离心力离心 5 分钟来分层。小心地将大部分顶部水层（避开中间层）转移到一个新管中。
3. 向液体样品中添加 300 µl 氯仿/异戊醇 (24:1)，并涡旋 30 秒钟充分混合。
4. 使用微量离心机以 16,000 x g 的离心力离心 5 分钟来分层。小心地将大部分顶部水层（避开中间层）转移到一个新管中。
5. 向每份液体样品中添加 25 µl 3M 乙酸钠 (pH 5.2)、1 µl 20 mg/ml 糖原和 600 µl 100% 乙醇，并涡旋 30 秒钟混合。
6. 样品在 -80°C 下孵育 1 小时或在 -20°C 下孵育过夜来使 DNA 沉淀。
7. 用微量离心机在 4°C 下以 16,000 x g 离心 5 分钟来使 DNA 沉淀。
8. 小心地移除上清液，用 70% 乙醇洗涤沉淀物。
9. 用微量离心机在 4°C 下以 16,000 x g 离心 5 分钟来使 DNA 沉淀。
10. 移除上清液，并风干沉淀物。
11. 在 50 µl 1X TE 缓冲液或无核酸酶水中重悬沉淀物。这是纯化的 DNA。（安全停止）样本在 -20°C 下最多保存 6 个月。

VI. 用 qPCR 定量 DNA

建议：

• 试剂盒中包含的Sample Normalization Primer Set 针对酿酒酵母 ACT1 基因，可用于定量Sample Normalization Spike-In酵母 DNA 的信号来进行样品标准化（可选）。
• 试剂盒中包含的额外对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因（#7014 or #7015），可用来对 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb 样品进行定量实时 PCR 分析。如果用户对其他物种进行 CUT&RUN，则用户需要为该物种设计相应的对照引物，并确定最佳 PCR 条件。
• PCR 引物选择至关重要。对于 CUT&RUN，PCR 扩增子大小应大约为 60-80 bp 长。引物的最佳熔解温度应设计为 60°C 左右，GC 含量应在 50% 左右。
• 2 µl 纯化的 DNA 足以对组蛋白、转录因子和辅因子的靶基因进行 qPCR 介导的定量。
• 建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。
• 使用带滤嘴的移液器吸头，从而最大限度地减少污染风险。

1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应包括阳性对照三甲基组蛋白 H3 Lys4 样品、阴性对照兔 IgG 样品、一个检查 DNA 污染的不含 DNA 的试管以及梯度稀释的input DNA（未稀释、1:5、1:25、1:125），以创建标准曲线，确定扩增效率，并对每份免疫富集样品中的 DNA 数量进行定量。

   注：如果进行样品标准化，仅 CUT&RUN 样品使用 Sample Normalization Primer Set 分析 。input DNA 不包含Normalization Spike-In DNA。

2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。每次 PCR 反应设置 2-3 次复孔。添加足量试剂来弥补损耗的体积（1-2 次额外反应）。向每支 PCR 反应管或每个孔中添加 18 μl 反应混合物。

试剂	1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
Nuclease-free H2O #12931	6 μl
5 µM 引物	2 μl
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989	10 μl

4. 启动以下 PCR 反应程序：

a.	初始变性	95°C，3 分钟
b.	变性	95°C，15 秒钟
c.	退火和延伸	60°C，60 秒钟
d.	重复步骤 b 和 c，共循环 40 次。

5. 使用实时 PCR 仪的自带软件，分析定量 PCR 结果。或者，可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式，手动计算 IP 效率。采用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。
   • 输入百分比 = 100% x 2^{（C[T] 100% 输入样品 – C[T] IP 样品）}
   • C[T] = C_T = PCR 反应的平均循环阈值
6. 对于样品标准化，选择样品标准化引物组 C[T] 值最低的样品作为选定样品（例如下表示例中的样品 1），并使用以下方程式计算其他样品的标准化系数。使用各自标准化系数调整待测引物组的信号。

qPCR 检测样品标准化示例（见图 8)

	样品标准化引物组的 C[T] 值	**qPCR 的标准化系数	标准化之前的信号（从步骤 5 中计算出的input [%]）	标准化之后的信号
样品 1	23.31	2(23.31-23.31)=1.00	24.4%	24.4%/1.00=24.4%
样品 2	24.24	2(23.31-24.24)=0.52	12.0%	12.0%/0.52=23.1%
样品 3	25.08	2(23.31-25.08)=0.29	6.28%	6.28%/0.29=21.7%
样品 4	26.30	2(23.31-26.30)=0.13	2.72%	2.72%/0.13=20.9%

**qPCR 的标准化系数 = 2^{（C[T] 选定样品 – C[T] 其他样品）}

图 8. 应用添加的Spike-In DNA对 CUT&RUN 信号进行 qPCR 标准化分析。对数量渐减的 HCT116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751（上小图）或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499（下小图）进行 CUT&RUN。使用 SimpleChIP^® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP^® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP^® Human Β-Actin 3' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP^® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为与 100,000 个细胞的input染色质总量相对应的信号。左图中为非标准化的富集结果。在每次反应中，按照与起始细胞数量成比例的方式添加 Sample Normalization Spike-In DNA。根据每份样品中添加 DNA 所产生的 qPCR 信号差异，将 CUT&RUN 信号标准化为含 100,000 个细胞的样品。右图显示了标准化后的富集。

VII. NG-Sequencing文库构建

用这种试剂盒制备的免疫富集 DNA 样品直接兼容 NG-seq。要构建下游 NG-seq DNA 文库，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于在 Illumina^® 平台上测序，我们建议使用 SimpleChIP^® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina^® #56795 和 SimpleChIP^® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina^® #29580 或 #47538。

DNA 文库制备的其他建议：

• DNA 末端制备（SimpleChIP^® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina^® #56795 的第 I 部分步骤 4）期间，更改热循环仪程序，以在 50^°C 下孵育 30 分钟，而不是在 65^°C 下孵育 30 分钟，以避免 DNA 小片段变性。变性 DNA 片段与接头蛋白连接不兼容。
• 纯化接头蛋白连接的 DNA（SimpleChIP^® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina^® #56795 的第 III 部分步骤 1）和文库 DNA（SimpleChIP^® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina^® #56795 的第 V 部分步骤 1）时，向样品中添加 1.1X 体积（而不是 0.9X 体积）的 AMPure^® XP 珠子或 SPRIselect^® 珠子，以提高对更小DNA片段的捕获。
• 在对接头蛋白连接的 DNA 进行 PCR 富集（SimpleChIP^® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina^® #56795 的第 IV 部分步骤 3）期间，将退火和延伸时间从 75 秒缩短到 15 秒，以避免wen文库中的 DNA 大片段 (> 1,000 bp) 的扩增。
• CUT&RUN 检测中的 DNA 产量可能低于我们建议用于 ChIP-seq 库制备的 5 ng 起始 DNA。如果 DNA 产量低于 5 ng，我们建议将 PCR 扩增周期数增加到 12-15 个周期，以生成 DNA 浓度为 10-30 ng/µl 的库。
• CUT&RUN 中产生的背景信号很低，因此每份样品 5 百万个读数的测序深度对于组蛋白修饰和转录因子而言通常已经足够了。如果每份样品的测序深度大于 1500 万，则读取的重复率显著增加。如果每份样品的测序深度低于两百万，则信噪比会降低。
• 进行样品标准化时，将所有样品的 CUT&RUN 测序数据比对至测试参照基因组（例如人）和样品标准化酿酒酵母基因组。选择酵母unique reads数最少的样品作为选定样品（例如下表中的样品 1），并使用下方的方程式计算其他样品的标准化系数。使用各自标准化系数来减低与每份样品的测试参考基因组对应的unique reads数。使用缩小的数据集进行进一步的 NGS 分析。

NGS 检测样品标准化示例（见图 9)

	与酵母对应的unique reads数	NGS 的标准化系数	标准化之前与测试参考基因组对应的unique reads数	NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母 reads数/其他样品的酵母unique reads数
样品 1	219,275	219,275/219,275 = 1.00	5,077,747	5,077,747 X 1.00 = 5,077,747
样品 2	411,915	219,275/411,915 = 0.53	9,896,671	9,896,671 X 0.53 = 5,268,306
样品 3	816,235	219,275/816,235 = 0.27	17,842,773	17,842,773 X 0.27 = 4,793,320
样品 4	1,120,826	219,275/1,120,826 = 0.20	23,836,679	23,836,679 X 0.20 = 4,663,339

NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母unique reads数/其他样品的酵母unique reads数

附录 A：测试细胞对洋地黄皂苷的敏感性

In the CUT&RUN kit protocol, the addition of digitonin to the buffers facilitates the permeabilization of cell membranes and entry of the primary antibody and pAG-MNase enzyme into the cells and nuclei. 因此，缓冲液中有足量的洋地黄皂苷对抗体和酶的成功结合以及靶向基因位点的消化至关重要。不同细胞系对洋地黄皂苷细胞透化有不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的洋地黄皂苷量应足以对大多数细胞系进行透化，但我们仍然建议对你的特定细胞系进行初步测试。我们发现，添加过量的洋地黄皂苷对本实验没有损害，因此无需生成浓度曲线。所以，进行快速测试以确定建议的洋地黄皂苷量是否适合你的细胞系就足够了。

在开始之前：

• 取出洋地黄皂苷溶液，并在 90-100°C 下加热 5 分钟。确保完全解冻。立即将已融化的洋地黄皂苷溶液放在冰上。

  注：洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上，并在实验完成后保存在 -20°C 下。

• 每个细胞系制备 100 µl 洋地黄皂苷缓冲液（10 µl 10X 洗涤缓冲液 + 2.5 µl 洋地黄皂苷 + 87.5 µl 水）。此测试无需添加亚精胺或蛋白酶抑制剂。

1. 用一个 1.5 ml 试管收集 100,000 个细胞。
2. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
3. 在 100 µl 洋地黄皂苷缓冲液中重悬细胞沉淀物，然后在室温下孵育 10 分钟。
4. 将 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝染料混合。
5. 使用血细胞计数器或细胞计数器计算染色细胞的数量和细胞总数。充分通透会导致 > 90% 的细胞被台盼蓝染色。
6. 如果被台盼蓝染色的细胞不到 90%，则增加洋地黄皂苷缓冲液中添加的洋地黄皂苷溶液的量，并重复步骤 1-5，直到 > 90% 的细胞被通透和染色。在第 I、II 和 III 部分中采用上述洋地黄皂苷溶液的量。

附录 B：对输入样品进行超声处理优化

建议对input DNA 样品进行超声处理，因为 DNA 纯化离心柱只能纯化片段化的基因组 DNA (< 10 kb)。此外，片段化的基因组 DNA (< 1 kb) 可在 NG-seq 分析中用作阴性对照。应优化超声处理，以便input DNA 的长度为 100-600 bp。

我们建议使用input样品进行 NG-seq，因为它能方便且无偏倚的呈现细胞基因组。虽然 IgG 样品也可在 NG-seq 中用作阴性对照，但由于存在非特异性结合，它可能会显示基因组特定区域出现富集。非片段化input DNA 可用于 qPCR 分析。但必须使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化非片段化的 DNA。

在开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。

• 取出 DNA Extraction Buffer，并在室温下回温，确保它完全融化成溶液。
• 每份input样品制备 2.1 ml 1X 洗涤缓冲液（210 µl 10X 洗涤缓冲液 + 1.89 ml 水），并让其平衡到室温，以最大程度地减少细胞应激。无需向此洗涤缓冲液添加亚精胺或蛋白酶抑制剂混合物。
• 每份input样品制备 2 µl 蛋白酶 K + 0.5 µl RNAse A，添加到 197.5 µl DNA Extraction Buffer（每份input样品 200 µl）中。

1. 针对每个超声摸索条件的input样品，收集 100,000 个细胞到一个1.5ml试管。
2. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
3. 轻轻上下吹打，以在 1 ml 1X 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。
4. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
5. 重复步骤 3 和 4一次来再次清洗细胞沉淀物。
6. 每 100,000 个细胞添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液，并轻轻上下吹打来重悬细胞沉淀物。
7. 对于每个超声处理的条件，分装 100 µl 细胞悬液到一个新管。

   注：在步骤 9中，在 55 °C 下孵育样品，因此建议使用一个可封盖的 1.5 ml 管子，以减少孵育过程中出现蒸发。

8. 向每份样品添加 200 µl DNA 提取缓冲液（+ 蛋白酶 K + RNAse A），并上下摇晃移液管来混合。
9. 将试管放在 55°C 下 1 小时，保持摇晃混匀试管。
10. 将试管放在冰上 5 分钟，让样品完全冷却。
11. 设定一个以 15 秒脉冲声处理的周期数渐增的时程实验，以确定你的超声波仪的最佳声处理条件。确保在两次脉冲之间将样品放在冰上孵育 30 秒钟。
12. 在 4°C 下用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。将上清液转移到一根新的 1.5 ml 微量离心管。
13. 按照第 V 部分的说明，使用 DNA 纯化离心柱或使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA 样品。
14. 从离心柱中洗脱 DNA，或在 30 µl 1X TE 缓冲液或无核酸酶水中重悬 DNA沉淀物。
15. 通过电泳确定 DNA 片段大小。将 > 15 µl 样品上样到含 100 bp DNA 标准分子marker的 1% 琼脂糖凝胶上。建议使用无染料上样缓冲液（30% 甘油）来更好地观察凝胶上的 弥散DNA 。
16. 选择能产生最佳 DNA 片段大小 (100-600 bp) 的超声处理条件，并用于第 IV 部分步骤 4 中的input样品制备。如果未达到最佳声处理条件，则增加或减少超声波仪的功率设置或声处理周期数，并重复声处理时程实验。

附录 C：CUT&RUN Kit Troubleshooting Guide

问题	可能的原因	建议
问题	可能的原因	建议
1. 在实验期间，Concanavalin A 珠子会结块。	珠子结块是正常的，并且通常不会影响检测。	轻轻上下吹打来重悬结块的珠子。
	室温孵育珠子和细胞的时间过长。	在 4°C 下激活 Concanavalin A 珠子，并且细胞孵育不超过 5 分钟（第 I 部分步骤 14）。
	细胞在制备期间裂解。	确保在室温下尽快制备细胞，以最大程度地减少细胞应激（第 I 部分步骤 7-16）。
	洋地黄皂苷浓度可能太高。	一些细胞可能对洋地黄皂苷更敏感，且在更高浓度下裂解。减少检测中的洋地黄皂苷量，但要确认使用的量足以进行细胞透化（见附录 A）。
2. 使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法时，在纯化的 DNA 样品中未检测到 DNA。	这通常发生在使用起始数量较少的细胞时（< 10,000 个细胞）起始时，但当使用建议的 100,000 个起始细胞时应能检测到 DNA。	确保使用基于picogreen 的 DNA 定量测定法。使用 NanoDrop、Bioanalyzer® 或 Tapestation® 通常无法检测到纯化的 DNA。
	在制备期间，可能会发生细胞计数下降，细胞丢失或裂解。	起始细胞培养应为 60-90% 融合度且看起来健康 (> 90% 活细胞）。
		确保在室温下尽快制备细胞，以最大程度地减少细胞应激。
		清洗试管中的所有细胞，以最大程度地减少细胞丢失（第 I 部分步骤 7-16）。
	洋地黄皂苷不能有效使细胞通透。	不使用时，确保将洋地黄皂苷溶液保存在 -20°C 下，因为保存在 -20°C 以上时，它不稳定。
		确保测试并确认使用的洋地黄皂苷量足以通透您的特定细胞系（见附录 A）。
	pAG-MNase 酶在检测中无法正常工作。	pAG-MNase 的稳定性很高，并且在妥善保存时应能保持长时间的活性。
		pAG-MNase 需要 Ca2+ 二价阳离子才能激活。确保添加氯化钙来激活酶（第 III 部分步骤 8）。
		确保消化 30 分钟，以使酶能充分消化染色质（第 III 部分步骤 9）。
	在反应中未加入足量的抗体，或抗体在 CUT&RUN 实验中不工作。	并非所有抗体都可应用于 CUT&RUN 。如可能，使用一种经 CUT&RUN 验证的抗体。或者，一些经 ChIP 和 IF 验证的抗体对 CUT&RUN 也有效。
		确保包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb，以证实您的检测是有效的。
3. qPCR 或 NG-seq 分析中没有信号。	查看问题 2 的可能原因。	查看问题 2 的建议。
	消化温度可能太低。	我们发现，在冰上（0°C）进行消化可显著降低靶标染色质片段的回收率，从而导致 qPCR 和 NG-seq 信号降低。请确保在 4°C 的控温板上或在冰箱中进行消化。
	qPCR 反应中未添加足量的 DNA。	向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。
	NG-seq DNA 库制备中未添加足量的 DNA。	确保使用一种基于 picogreen 的 DNA 定量测定法来定量纯化的 DNA，并使用建议的起始 DNA 量和 PCR 扩增周期（见第 VII 部分）。
	PCR 扩增区域可能横跨无核小体的区域。	CUT&RUN 检测中生成的 DNA 片段通常比 ChIP 实验中生成的 DNA 片段小。因此，设计引物来生成不长于 60-80 bp 的扩增子至关重要。
4. qPCR 或 NG-seq 分析中的背景信号高。	样品处理过度，基因组 DNA 已经被高度碎裂。	始终使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 阴性对照抗体来确定 CUT&RUN 检测中的背景信号。
		为最大限度地减少 DNA 碎裂，避免在细胞再悬浮期间剧烈涡旋和产生气泡。
	由于细胞应激和裂解，基因组 DNA 已被高度碎裂。	确保在室温下尽快制备细胞，以最大程度地减少细胞应激。清洗试管中的所有细胞，以最大程度地减少细胞丢失（第 I 部分步骤 7-16）。
	消化温度可能太高。	应在 4°C 的控温板上或在冰箱中进行消化。在较高温度下消化会显著增强背景信号。
		开始消化之前，请确保在冰上将样品和氯化钙预冷。
	非特异性基因组 DNA 大片段还会扩散到上清液中，并且污染由靶向酶解剪切产生的较小片段。	请勿在 37°C 下孵育样品超过 10 分钟，也不要在孵育期间摇晃样品（第 III 部分步骤 11）。十分钟足以使被消化的片段扩散到上清液中。
		在 qPCR 分析前，使用 AMPure® XP Beads 或 SPRIselect® Reagent Kit 选择大小可以去除基因组 DNA 大片段。
		对于 NG-seq 分析，在文库构建期间缩短 PCR 扩增时间（10-15 秒钟），即可排除 DNA 大片段扩增。
	检测中使用过多抗体，导致非特异性结合和消化。	如可能，确保按推荐的稀释度使用一种经 CUT&RUN 验证的抗体。如果没有，经 ChIP 验证和经 IF 验证的抗体在建议的 ChIP 和 IF 稀释度下通常有效。您可能需要在检测中通过滴定实验确定抗体用量。