蛋白质印迹法实验步骤
A. 溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
- 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 配制 1 L 1X PBS：添加 50 mL 20X PBS 至 950 mL dH2O 中，混合。
- 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 配制 1 L 1X TBS：添加 100 mL 10X 至 900 mL dH2O 中，混匀。
- 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723)；通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液， 配制新鲜的 3X 还原上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
- 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 配制 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 mL 10X 电泳缓冲液加入 900 mL dH2O 中，混匀。
- 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 配制 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 mL 10X 转移缓冲液加入到 200 mL 甲醇 + 700 mL dH2O 中，混匀。
- 10X 含 Tween 20 的 Tris 盐缓冲液 (TBST)：(#9997) 配制 1 L 1X TBST：添加 100 mL 10X TBST 至 900 mL dH2O 中，混匀。
- 脱脂奶粉：(#9999)。
- 封闭液：含有 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；如果配制 150 mL，将 7.5 g 脱脂奶粉加入到 150 mL 1X TBST 中并混匀。
- 洗涤缓冲液：（#9997）1X TBST。
- Bovine Serum Albumin (BSA)：(#9998)。
- 一抗稀释缓冲液：含有 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST（具体使用哪种请参考一抗产品网页的指示） ；如要配制 20 mL，向 20 mL 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉，并充分混匀。
- 生物素化的蛋白分子量标准品检测包：(#7727)。
- Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)。
- 印迹膜和纸：(#12369) 本实验步骤 已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常，建议使用 0.2 µm 孔径的膜。
- HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。
- 检测试剂：LumiGLO 化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。
B. 蛋白质印迹
配制样品的常规流程。
- 添加含有调节因子的新鲜培养基，对细胞进行所需时间的处理。
- 吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞后将PBS吸出。
- 加入 1X SDS 样品缓冲液（对于 6 孔板，每孔加入 100 µL；对于直径 10 cm 的平板，加入 500 µL）裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管 。置于冰上。
- 超声裂解10–15秒，完成细胞裂解并剪切 DNA（以减轻样本粘度）。
- 加热 20 µL 样本至 95–100°C 5分钟；在冰上冷却。
- 用微量离心机离心 5 分钟。
- 上样 20 µL 至 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm)。
注：建议上样预染分子量标准品（#59329， 5 µL/泳道）以验证电转移，并上样生物素化的蛋白分子量标准品（#7727， 10 µL/泳道）确定分子量。 - 电转移至硝酸纤维素膜 (#12369)。
C. 膜封闭和抗体孵育
注：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；针对不同尺寸的膜，请对体积作出 相应调整。
一、膜封闭
- （可选）转移后，在室温下用 25 mL TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。
- 将膜在室温下于 25 mL 封闭液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
- 用 15 mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
二、一抗孵育
根据所用的一抗，继续后续对应的实验步骤。
对于非偶联的一抗
- 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释比例和稀释液配制）置于 10 mL 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15 mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 将膜与种属匹配的 HRP 偶联二抗（#7074 或 #7076，按 1:2000 的比例）和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）于 10 ml 封闭液中室温孵育 1 小时，同时温和振荡， 以检测生物素化蛋白标志物。
- 用 15 mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 继续进行检测（D 部分）。
对于 HRP 偶联一抗
- 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释比例配制）置于 10 mL 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15 mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- （可选）在 10 mL 封闭液中用 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）在室温下孵育 1 小时，同时温和振荡，以检测生物素化蛋白质标志物。
- 用 15 mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 继续进行检测（D 部分）。
对于生物素化的一抗
- 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释比例配制）置于 10 mL 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15 mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 将膜与 Streptavidin-HRP（#3999，按适宜的
稀释比例）于 10 mL 封闭液中在室温下孵育 1 小时，同时温和振荡。
注：Streptavidin-HRP 使生物素化蛋白质标志物可视化。无需额外 使用 Anti-Biotin, HRP-Linked Antibody 进行孵育。 - 用 15 mL TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 继续进行检测（D 部分）。