免疫沉淀法实验步骤（针对天然蛋白质）

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法，随后通过蛋白质免疫印迹或激酶活性检测进行分析。使用 Protein A Magnetic Beads #70024 时，请参阅利用磁性分离的免疫沉淀实验步骤。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20 X Phosphate Buffered Saline (PBS) #9808：要制备 1 L 1X PBS：添加 50 mL 20X PBS 至 950 mL dH2O 中，混合。
2. 10X Cell Lysis Buffer #9803：要制备 10 mL 1X 细胞裂解缓冲液，添加 1 mL 10X 细胞裂解缓冲液至 9 mL dH2O 中，混合。

   注：使用前，立即加入 1 mM PMSF #8553。

3. 3X SDS 样品缓冲液：使用 Blue Loading Buffer Pack #7723。通过添加 1/10 体积的 30X DTT 到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液中，制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液。
4. Protein A 或 G 琼脂糖微珠（针对非偶联的一抗）：将 Protein A #37478 用于小鼠 IgG 免疫沉淀法。
5. 固定化 Streptavidin (Sepharose Bead Conjugate) #3419：轻轻地涡旋搅拌小瓶，并在每次免疫沉淀中使用 10 µL。
6. 10X Kinase Buffer（用于激酶测定）#9802：要制备 1 mL 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µL 10X 激酶缓冲液加入到 900 µL dH2O 中，混合。
7. ATP (10 mM)（用于激酶测定）#9804：要制备 0.5 mL ATP (200 µM)，将 10 µL ATP (10 mM) 加入到 490 µL 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节分子的新鲜培养基，对细胞进行一段时间的处理。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS 并给每个培养板 (10 cm) 添加 0.5 mL 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，并将其放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，并且将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上对样品进行 3 次超声处理，每次 5 秒。
6. 使用微量离心机在 4°C 下以 14,000 x g 的离心力离心 10 分钟，然后将上清液转移到一个新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（针对非偶联和生物素化抗体的可选步骤）

强烈建议进行细胞裂解物预澄清步骤，以减少与 Protein A、Protein G 或 Streptavidin 微珠的非特异性蛋白结合。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。

1. 向 1 mg/mL 的 200 μL 细胞裂解液中加入 20 μL Protein A
2. 在 4°C 下，旋转孵育 30-60 分钟。
3. 使用微量离心机在 4°C 下离心 10 分钟，然后将上清液转移到一个新管中。
4. 根据所用的一抗，继续后续对应的实验步骤。

免疫沉淀法：

重要事项：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行实验。

使用非偶联的一抗

1. 将一抗（按产品网页或产品说明书中推荐的合适稀释比例制备）加入到浓度为 1 mg/mL 的 200 µL 细胞裂解液中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
2. 添加 Protein A #37478 琼脂糖（20 μL 50% 珠子混悬液）。轻轻摇动，在 4°C 下孵育 1-3 小时。
3. 用微量离心机在 4°C 下离心 30 秒。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物 5 次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

使用生物素化一抗

1. 将生物素化抗体（按产品网页或产品说明书中推荐的合适稀释比例制备）加入到浓度为 1 mg/mL 的 200 µL 细胞裂解液中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
2. 轻轻混合固定化 Streptavidin (Sepharose Bead Conjugate) #3419，并添加 10 µL 珠子混悬液。轻轻摇动，在 4°C 下孵育 2 小时。
3. 用微量离心机在 4°C 下离心 30 秒。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物 5 次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

使用固定化的抗体 (Sepharose Bead Conjugate)

1. 轻轻混合，并加入固定了抗体的磁珠 (10 µL) 到浓度为 1 mg/mL 的 200 µL 细胞裂解液中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
2. 用微量离心机在 4°C 下离心 30 秒。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物 5 次。洗涤间期，保持样品于冰上。
3. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

使用固定化的抗体 (磁珠偶联)

1. 轻轻混合，并加入固定化的珠子接合物 (10 µL) 到浓度为 1 mg/mL 的 200 µL 细胞裂解液中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
2. 将试管放在 Magnetic Separation Rack #14654 上，使磁珠沉淀。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液洗涤 5 次。
3. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

根据分析类型，继续后续对应的实验步骤。

注：对于磁珠，请勿离心；而应使用 Magnetic Separation Rack #14654。

用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 用 20-40 µL 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后再用微量离心机离心 30 秒。
2. 将样品加热至 95-100°C 并持续 2-5 分钟，然后用微量离心机以 14,000 x g 的离心力离心 1 分钟。
3. 将样品 (15-30 µL) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。
4. 采用蛋白质免疫印迹法分析样品。请参阅蛋白免疫印迹法实验步骤。

注：为尽量减少变性重链对目标条带的掩蔽或由变性轻链产生的干扰，建议采用以下二抗：

对于分子量约为 50 kDa 的蛋白质：

Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb #45262

Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate) #93702

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127

对于分子量约为 25 kDa 的蛋白质：

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127

用激酶活性测定法进行分析

1. 用 500 µL 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
2. 用补充有 200 µM ATP 和合适底物的 40 µL 1X 激酶缓冲液重悬沉淀。
3. 30°C 下孵育 30 分钟。
4. 用 20 µL 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再用微量离心机离心 30 秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
6. 将样品加热至 95-100°C 并持续 2-5 分钟，然后用微量离心机以 14,000 x g 的离心力离心 1 分钟。
7. 将样品 (15-30 µL) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。