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PathScan® 夹心 ELISA 抗体对实验步骤

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 欲制备 1 L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O，混匀。
  2. 洗涤缓冲液：1X PBS/0.05% Tween® 20、(20X PBST #9809)。
  3. 封闭液：1X PBS/0.05% Tween® 20、1% BSA。

  4. 1X 细胞裂解缓冲液：10X Cell Lysis Buffer (#9803)：要制备 10 ml 1X Cell Lysis Buffer，将 1 ml 10X Cell Lysis Buffer 加入到 9 ml dH2O 中，并混匀。这种缓冲液可存放在 4°C 下供短期使用（1–2 周）。

    建议：使用之前即刻添加 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (#8553)。

  5. Bovine Serum Albumin (BSA)：(#9998)。
  6. TMB Substrate：(#7004)。

  7. STOP Solution：(#7002)

    注：每天都应制备新鲜试剂。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。使用含有调节因子的新鲜培养基对细胞进行一段时间的处理。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1X PBS 润洗一次。
  3. 移除 PBS 并添加含 1 mM PMSF 的 0.5 ml 冰冷的 1X Cell Lysis Buffer 至每块平板（直径 10 cm），并在冰上孵育平板 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理破碎细胞。
  6. 在 4°C 用微量离心机离心 10 分钟 (x14,000 rpm)，并将上清液转移至一支新试管。上清液即为细胞裂解物。可按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

  1. 培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1,200 rpm）去除培养基。使用含有调节因子的新鲜培养基对细胞进行一段时间的处理。
  2. 通过低速离心分离（约 1,200 rpm）采集细胞，并用 5–10 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在 2.0 ml 含 1 mM PMSF 的 1X Cell Lysis Buffer 中裂解。
  4. 在冰上超声处理破碎细胞。
  5. 在 4°C 用微量离心机离心 10 分钟 (x14,000 rpm)，并将上清液转移至一支新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 包被程序

  1. 用 200 µl dH2O 淋洗微量平板，弃去液体。在纸巾上蘸干以确保各孔干燥。
  2. 在 1X PBS 中 1:100 稀释捕获抗体。对于单块 96 孔板，添加 100 µl 捕获抗体母液至 9.9 ml 1X PBS。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 4°C 孵育过夜（17–20 小时）。
  3. 在过夜包被后，轻柔地揭开平板的盖子，并洗涤各孔：
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用洗涤缓冲液洗涤 4 次，每次 200 µl/孔。每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上，拍击力度要足够大，这样才能清除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
    3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  4. 封闭平板。添加 150 µl 封闭液/孔，盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  5. 在封闭后，洗涤平板（ C 部分，步骤 3）。平板可直接使用。

D. 检测程序

  1. 裂解物可以不稀释使用或在封闭液中稀释使用。每孔添加 100 µl 裂解物。盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  2. 洗涤平板（ C 部分，步骤 3）。
  3. 在封闭液中 1:100 稀释检测抗体。对于单块 96 孔板，添加 100 µl 检测抗体原液至 9.9 ml 封闭液中。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 1 小时。
  4. 洗涤平板（ C 部分，步骤 3）。
  5. 将二抗，即链霉亲和素抗小鼠或抗兔-HRP，在封闭液中 1:1000 稀释。对于单块 96 孔板，添加 10 µl 二抗原液至 9.99 ml 封闭液中。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 30 分钟。
  6. 洗涤平板（ C 部分，步骤 3）。
  7. 向每个孔中添加 100 µl TMB Substrate。盖住平板并在 37°C 孵育 10 分钟。
  8. 向每个孔中添加 100 µl STOP Solution。温和振摇数秒。
  9. 在酶标仪上在 450 nm 读取吸光度。
    1. 目视测定：在添加 STOP Solution 后 30 分钟内读取。
    2. 用分光光度计测定：用无绒织物擦拭孔的底面。添加 STOP Solution 后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。

2008 年 1 月发布

2013 年 9 月修订