用于 Illumina 系统的 CUT&Tag DNA 文库制备实验步骤
下一代测序分析 (NG-seq) 是一种 可以在核酸酶靶向切割和释放 (CUT&Tag) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并定量靶标 DNA 富集情况的 高通量方法。CUT&Tag Dual Index Primers 和 PCR Master Mix for Illumina Systems 试剂盒非常适合多重样品制备，用于在 Illumina 系统平台上进行 NG-seq。这种试剂盒可以 用于生成可并入单个测序反应中多达 96 个不同的条形码化 CUT&Tag DNA 文库。本产品兼容 于借助 CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561 生成的 CUT&Tag DNA 样品以及来自其他酶切法片段化测定法 （例如 ATAC-seq）的 DNA 样品。本产品与来自 SimpleChIP® Chromatin IP Kit（#9003、#9005、#56383）的 ChIP-DNA、来自 CUT&RUN Assay Kit (#86652) 的 CUT&RUN DNA 或 CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647 不兼容。
兼容的检测试剂盒：
- CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561
- &CUTTag Assay Kit #77552
不兼容的检测试剂盒：
- SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
- SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
- SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
- SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
- SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
- &CUTRUN Assay Kit #86652
- CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647
- DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795
所需的试剂
包括的试剂：
- CUT&Tag PCR Master Mix #63228
- CUT&Tag Index 501 Primer for Illumina Systems #84876
- CUT&Tag Index 502 Primer for Illumina Systems #27488
- CUT&Tag Index 503 Primer for Illumina Systems #55058
- CUT&Tag Index 504 Primer for Illumina Systems #61793
- CUT&Tag Index 505 Primer for Illumina Systems #70447
- CUT&Tag Index 506 Primer for Illumina Systems #87803
- CUT&Tag Index 507 Primer for Illumina Systems #26897
- CUT&Tag Index 508 Primer for Illumina Systems #52106
- CUT&Tag Index 701 Primer for Illumina Systems #71100
- CUT&Tag Index 702 Primer for Illumina Systems #88112
- CUT&Tag Index 703 Primer for Illumina Systems #23497
- CUT&Tag Index 704 Primer for Illumina Systems #37884
- CUT&Tag Index 705 Primer for Illumina Systems #50105
- CUT&Tag Index 706 Primer for Illumina Systems #65909
- CUT&Tag Index 707 Primer for Illumina Systems #84796
- CUT&Tag Index 708 Primer for Illumina Systems #17160
- CUT&Tag Index 709 Primer for Illumina Systems #29209
- CUT&Tag Index 710 Primer for Illumina Systems #41919
- CUT&Tag Index 711 Primer for Illumina Systems #54212
- CUT&Tag Index 712 Primer for Illumina Systems #70020
未包括的试剂：
- AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
- 80% 乙醇（新鲜制备）
- 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
- 磁力架/支架
- Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation 系统 (Agilent Technologies, Inc.)
- PCR 管或板和 PCR 仪
CUT&Tag Dual Index Primers 和 PCR Master Mix for Illumina Systems 实验步骤
| 安全停止 | 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点 。 |
一、简单的合并指南：
双索引引物策略利用每个引物内的两个 8 碱基索引。index 7 引物包含 P7 序列周围的索引，而 index 5 引物则包含 P5 序列周围的索引。对序列待测的样品的两端添加特殊索引， 即可实现双索引。将 12 个 index 7 引物的一端与 8 个 index 5 引物的一端结合在一起，便可为多达 96 种不同样品建立特殊索引。
Illumina NG-seq 系统使用红色激光/LED 给 A/C 测序，并使用绿色激光 /LED 给 G/T 测序。对于每个周期，需要读取红色和绿色通道， 以确保获得正确的图像配准（即 A 或 C 必须存在于每个周期中，且 G 或 T 也必须存在于每个周期中）。 如果未保持此色彩平衡，则该索引读数测序可能会无效 。请检查每个要使用的索引的序列， 以确保每个周期的红色和绿色通道中都有信号。 请参见以下示例：
| GOOD | |||
|---|---|---|---|
| CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems | CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems | ||
| Index 701 |
ATTACTCG |
Index 503 |
CCTATCCT |
| Index 702 |
TCCGGAGA |
Index 504 |
GGCTCTGA |
| Index 703 |
CGCTCATT |
Index 505 |
AGGCGAAG |
| Index 704 |
GAGATTCC |
Index 506 |
TAATCTTA |
| ������������������������ | ������������������������ | ||
| BAD | ||||
|---|---|---|---|---|
| CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems | CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems | |||
| Index 701 |
ATTACTCG |
Index 502 |
ATAGAGGC |
|
| Index 702 |
TCCGGAGA |
Index 504 |
GGCTCTGA |
|
| Index 703 |
CGCTCATT |
Index 506 |
TAATCTTA |
|
| Index 704 |
GAGATTCC |
Index 508 |
GTACTGAC |
|
| ������������������������ | ������������������������ | |||
以下表格列出了一些（但不是全部）可一起进行测序的 有效索引组合：
| Plex | CUT&Tag Index 7 primers for Illumina Systems | CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems |
| 2 |
Index 701 和 Index 702 Index 703 和 Index 704 Index 705 和 Index 706 Index 707 和 Index 708 Index 709 和 Index 710 Index 711 和 Index 712 |
任何 Index 5 引物 |
| 3 |
Index 701、Index 702 和 Index 703 Index 703、Index 704 和 Index 705 Index 705、Index 706 和 Index 707 Index 707、 Index 708 和 Index 709 Index 709、Index 710 和 Index 711 |
任何 Index 5 引物 |
| 4 |
Index 701、Index 702、Index 703 和 Index 704 Index 703、Index 704、Index 705 和 Index 706 Index 705、Index 706、Index 707 和 Index 708 Index 707、 Index 708、Index 709 和 Index 710 Index 709、Index 710、Index 711 和 Index 712 |
任何 Index 5 引物 |
| 5-12 | 任何有效的 Index 7 4-plex 与任何其他 i7 引物的组合 （根据需要） | 任何 Index 5 引物 |
| > 12 |
任何有效的 Index 7 4-plex 与任何其他 i7 引物的组合 （根据需要） |
Index 501、Index 502 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 503、Index 504 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 505、Index 506 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 507、Index 508 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） |
另一些其他有效组合如下文所列。选择一组有效的 CUT&Tag Index 7 引物和一组有效的 CUT&Tag Index 5 引物。每个 CUT&Tag Index 7 引物和每个 CUT&Tag Index 5 引物一同使用，形成所需数量的引物对，从而为获得所需文库数而进行 PCR 扩增。
| 12 样品池 |
(1) 一组 4 个 Index 7 引物 * 一组 3 个 Index 5 引物 (2) 一组 3 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 (3) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 2 个 Index 5 引物 |
| 26 样品池 |
(1) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 加上 任何 Index 7 引物和任何其他两个 Index 5 引物 （组 4 除外） (2) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 5 个 Index 5 引物 使用 30 个引物对中的 26 个来扩增 26 个文库 |
二、CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems：
每份 CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina systems 以 30 µl 的量提供。
| 产品 | 索引引物序列 | 预期的索引引物序列读段 |
| CUT&Tag Index 501 Primer for Illumina Systems |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA TAGCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TATAGCCT |
| CUT&Tag Index 502 Primer for Illumina Systems |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAT AGAGGCTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
ATAGAGGC |
| CUT&Tag Index 503 Primer for Illumina Systems |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCC TATCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CCTATCCT |
| CUT&Tag Index 504 Primer for Illumina Systems |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGG CTCTGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GGCTCTGA |
| CUT&Tag Index 505 Primer for Illumina Systems |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAG GCGAAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
AGGCGAAG |
| CUT&Tag Index 506 Primer for Illumina Systems |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA ATCTTATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TAATCTTA |
| CUT&Tag Index 507 Primer for Illumina Systems |
5´- AATGATACGGGCGACCACCGAGATCTACACCA GGACGTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CAGGACGT |
| CUT&Tag Index 508 Primer for Illumina Systems |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGT ACTGACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GTACTGAC |
其中 -s- 表示硫代磷酸键。
三、CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems：
每份 CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina systems 以 20 µl 的量提供。
| 产品 | 索引引物序列 | 预期的索引引物序列读段 |
| CUT&Tag Index 701 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGT AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTACTCG |
| CUT&Tag Index 702 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGGAGA |
| CUT&Tag Index 703 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGGCATACGAGATAATGA GCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGCTCATT |
| CUT&Tag Index 704 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCGCATACGAGATGGAAT CTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAGATTCC |
| CUT&Tag Index 705 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTG AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTCAGAA |
| CUT&Tag Index 706 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAA TTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAATTCGT |
| CUT&Tag Index 707 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTT CAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CTGAAGCT |
| CUT&Tag Index 708 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCA TTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TAATGCGC |
| CUT&Tag Index 709 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAG CCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGGCTATG |
| CUT&Tag Index 710 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGCGAA |
| CUT&Tag Index 711 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCG AGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCTCGCGC |
| CUT&Tag Index 712 Primer for Illumina Systems |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATC GCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
AGCGATAG |
其中 -s- 表示硫代磷酸键。
四、设置 PCR 反应
开始之前：
- 在室温下解冻 CUT&Tag Index Primers for Illumina systems 和 CUT&Tag DNA （或任何标签化 DNA）。快速旋转一次以收集 试管壁上的所有液体。
- 确保使用的 index 7 和 index 5 引物组合有效。 请参见第一和第二部分，验证是否选择了 正确的引物组合。
-
将以下组分添加到无菌 PCR 管或
PCR 板的单孔中。记录添加到每个 PCR 试管或孔的 CUT&Tag Index 5 和 CUT&Tag Index 7
引物。
试剂 1 次 PCR 反应所需的体积 (70 µl) CUT&Tag DNA（或任何标签化 DNA） 30 µl CUT&Tag PCR Master Mix 35 µl CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina Systems (10 µM) 2.5 µl CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina Systems (10 µM) 2.5 µl - 通过上下吹打彻底混合反应，并快速离心 以从试管壁或板孔的侧面收集所有液体。
-
将试管置于带热盖的热循环仪上，并使用以下 PCR 循环条件执行 PCR 扩增
：
a. 缺口填充 58°C，5 分钟 b. 缺口填充延伸 72°C，5 分钟 c. 初始变性 98°C，30 秒 d. 变性 98°C，10 秒 e. 复性和延伸 60°C，11 秒 对于每个 CUT&Tag 反应介于 20,000 个与 100,000 个之间的细胞，重复步骤 d 和 e，共 13 个循环。 对于每个 CUT&Tag 反应的 20,000 个以及更少的细胞，重复步骤 d 和 e，共 14-16 个循环。 注：过多的 PCR 循环导致文库多样性较低 和/或 NGS 读数重复率较高。 f. 终末延伸 72°C，1 分钟 g. 保持 4°C - 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，样品可在 -20°C 下保存。
注：在不同试管之间操作时，务必更换吸头，以避免交叉污染。如果从少于 30 µl 的 CUT&Tag DNA 开始，则加入无 DNA 酶的水以使体积补足至 30 µl。
注：在不同样品之间操作时，务必更换吸头， 以避免交叉污染。
五、清除 PCR 扩增物
开始之前：
- 如果使用 AMPure XP 珠子，则使这些珠子在使用前加温至室温至少 30 分钟。
- 通过管倒置或上下吹打来重悬 AMPure XP 珠子或 SPRIselect 珠子。
- 为每份样品制备 400 µl 80% 乙醇。
- 为每份样品制备大约 20 µl 的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)。
- 向第四部分步骤 3 的 70 µl PCR 反应中添加 70 µl (1.0X) 重悬的 AMPure XP 珠子或 SPRIselect 珠子。上下吹打至少 10 次来 混匀。在最后的混合过程中， 注意将所有液体排出吸头。
- 将样品置于在实验台上，在室温下孵育至少 5 分钟。
- 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟， 以让珠子与上清液分离。
- 小心清除和丢弃上清液。小心去除所有液体残留物， 但不要扰动含 DNA 靶标的珠子。
- 在将试管/平板放在磁力架上时，将新鲜制备的 200 µl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒， 随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰动含有 DNA 靶标的珠子。
- 重复步骤 5 一次，洗涤总计两次。确保在第二次洗涤后清除 所有可见的液体。
- 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时， 让珠子风干长达 5 分钟。
- 注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在珠子仍呈现光泽， 但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂， 则珠子太干。从磁力架上取下 试管/平板。每份样品添加 17 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，以洗脱珠子上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温下孵育至少 2 分钟。
- 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。 将 15 µl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到 新试管中。（安全停止）DNA 文库可储存在 -20°C 下，直至进一步使用为止。
- 测定文库 DNA 的浓度。
- 根据制造商的说明，使用 Agilent Bioanalyzer 或 TapeSatation 系统确定 CUT&Tag DNA 文库的 大小分布。
- 使用 10mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 调整纯化的最终文库样品的浓度，以进行高通量测序。请参阅 Illumina 测序手册，了解进行 NG-seq 所需的 DNA 库的最佳浓度和体积。
注：已扩增的 CUT&Tag DNA 文库的产量可能 因所使用的 DNA 定量方法而异。如果使用 Nanodrop 或 QIAxpert 系统，组蛋白靶标的 预期读数为 10-20 ng/µl，非组蛋白靶标的预期读数为 5-12 ng/µl。如果采用 Nanodrop 或 QIAxpert 系统时文库浓度低于 3 ng/µl ，对样品测序之前，请参阅 疑难解答指南 。如果使用 Qubit Fluorometric Quantification 系统或 Picogreen 检测法，组蛋白靶标的预期读数为 3-10 ng/µl，非组蛋白靶标的预期读数 可能低于 1 ng/µl。
注：TapeStation 系统上的高灵敏度 ScreenTape 检测方法（而非标准 ScreenTape 检测方法）为 CUT&Tag 文库质量评估提供了更好的方法。如果在使用 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统时 CUT&Tag DNA 文库显示出微弱、甚至不可见的信号，但只要阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 产生预期的文库产量 和/或 Bioanalyzer 峰，这表明实验总体成功 ，我们仍建议继续进行 NGS（详见我们的 CUT&Tag 博客）。
注：通常，来自组蛋白靶标的 CUT&Tag DNA 文库的浓度高于 来自非组蛋白靶标的 DNA 文库。我们使用 以下公式将文库浓度从 ng/µL 转换为 nM， 然后将每个文库样品稀释至相同浓度 (nM)， 旨在汇集：浓度 (nM) = 1,000,000 X 浓度 (ng/µL) / 文库平均大小 (bp) / 660。对于 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统不能识别文库平均大小的 CUT&Tag 文库， 我们建议使用 900 bp 的大小有意 汇集比正常产量文库更多的低产量文库。此外， 我们还建议合并这类文库，它们将具有比 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统上显示正常大小峰的文库多 5-10 倍的平坦信号 。这确保读数数目在所有样品之间 均匀分布。通常，文库汇集浓度 2 nM DNA 足以用于 NGS 目的， 不过浓度越高越好。