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DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) 实验步骤

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种可以在染色质免疫沉淀 (ChIP) 及核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并 定量靶标 DNA 富集情况的高通量方法。DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) 含有从 ChIP DNA 或 CUT&RUN DNA 生成高质量 DNA 测序文库供 Illumina Systems 平台上进行下一代测序分析所需的所有酶和缓冲液。快速、人性化的工作流程可最大程度地缩短产生和纯化 DNA 库的手动操作时间。

每一个试剂盒组分均进行严格的质控，并且对于每一个新批次， 都在 Illumina Systems 测序平台上通过构建和测序带有索引的文库来 对整套试剂进行功能性验证。

本产品必须联合 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 使用。本产品包含数量足以进行 24 次反应的试剂，并且兼容于酶解片段化或超声处理片段化、ChIP 富集的 DNA 和 CUT&RUN DNA 二者（针对富集自 ChIP 或 CUT&RUN 检测的 DNA， 提供了不同的实验步骤）。

兼容的检测试剂盒：
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580
Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
CUT&RUN Assay Kit #86652
CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647

不兼容的检测试剂盒：
CUT&Tag Assay Kit #77552
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
注：琼脂糖珠子被超声处理的鲑鱼精子 DNA 封闭，这将污染 DNA 库制备和 NG-seq。

所需的试剂：
包括的试剂：

  1. •（绿色）End Prep Enzyme Mix #73416
  2. •（绿色）End Prep Reaction Buffer #93209
  3. •（红色）Ligation Master Mix #46719
  4. •（红色）Ligation Enhancer #30147
  5. •（蓝色）Q5 PCR Master Mix (2X) #67488

未包括的试剂：

  1. Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
  2. Nuclease-free Water #12931
  3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
  4. 80% 乙醇（新鲜制备）
  5. 1X TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)
  6. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
  7. 磁力架/支架
  8. Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation 系统 (Agilent Technologies, Inc.)
  9. PCR 试管和 PCR 仪器
安全停止 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。

一、结束制备

进行 ChIP-seq 时，必须生成一个对照 DNA 测序库， 用于确定在 ChIP 实验和 DNA 文库制备过程中引入的、影响 DNA 富集的任何实验偏差 。用输入染色质（即用于进行 IP 的染色质）纯化的 DNA 通常用来 生成对照 DNA 文库。

起始物料：500 pg -1 µg ChIP DNA。为确保 DNA 测序文库的最佳多样性， 我们建议针对转录因子和辅因子 ChIP-seq，使用 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA；针对总组蛋白或组蛋白修饰 ChIP-seq，使用 50 ng 经 ChIP 富集的 DNA； 针对对照 DNA 测序文库，使用 50 ng 输入 DNA。如有必要，可使用少于 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA 进行文库生成；然而，由于扩增过程中存在 PCR 偏差，这可能会导致文库的多样性程度较低 。

开始之前：

  • 在室温下解冻 End Prep Reaction Buffer (•)。
  • 制备 1X TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)。
  1. 用无菌、不含核酸酶的试管制备 0.5-50 ng ChIP DNA 和相对输入 DNA（对照 DNA）。添加 1X TE，让每份 DNA 样品的最终体积为 50 µl。
  2. 向每份 DNA 样品中添加 3 µl End Prep Enzyme Mix (•) 和 7 µl End Prep Reaction Buffer (•)，使总反应体积为 60 µl。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物，并快速离心一次 以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会 干扰实验的进行。
  4. 放在热循环仪中，并进行以下流程：
    • 20 °C，30 分钟
    • 65 °C，30 分钟
    • 保持在 4 °C 下
  5. 继续进行接头连接（第二部分）。如有必要，将样品保存在 -20°C 下；但是， 可能会观察到产量略有下降（约 20%）。我们建议在停止之前继续进行接头连接 。

二、接头连接

开始之前：

  • Adaptor for Illumina Systems (•) 和 USER enzyme (•) 均可在 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中找到。
  • 在室温下解冻 Adaptor for Illumina Systems (•)。
  • 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。
  • 为每份样品制备大约 2.5 µl 的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)。
  1. 使用 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 稀释 Adaptor for Illumina Systems (•) 。如果起始 DNA 为 5 ng 至 100 ng，则以 1:10 的比例稀释接头，配制成 1.5 µM 的工作浓度。如果起始 DNA 少于 5 ng，则以 1:25 的比例稀释接头，配制成 0.6 µM 的工作浓度。
  2. 将 30 µl Ligation Master Mix (•)、1 µl Ligation Enhancer (•) 和 2.5 µl 稀释的 Adaptor for Illumina Systems 直接加至 60 µl End Prep Reaction Mixture（源于第一部分的步骤 5）。
    注：不建议提前制备含有稀释接头的反应预混物 。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合连接反应物，并快速旋转一次 以收集试管壁上的所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物充分混合， 因为混合不完全会导致连接效率降低 。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 在室温下孵育 15 分钟。
  5. 向连接混合物添加 3 µl USER Enzyme (•)。混匀并 在37°C 下孵育 15 分钟，加热盖设置为 ≥ 47°C。
  6. 继续清除接头蛋白连接的 ChIP DNA（第三部分）。（安全停止）或者，将样品在 -20°C 下保存过夜。

三、纯化不进行片段筛选的接头连接的 ChIP DNA

在纯化接头连接的 ChIP DNA 的阶段，不建议进行大小选择， 因为它会导致 ChIP-seq DNA 文库的产量和多样性急剧下降。

开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠子，则使这些珠子在使用前加温至室温至少 30 分钟 。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 为每份样品制备 400 µl 80% 乙醇。
  • 为每份样品制备 17 µl 的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)。
  1. 向每个接头连接反应添加 87 µl (0.9X) 重悬的 AMPure XP 珠子或 SPRIselect 珠子。上下吹打 至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中， 注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让珠子与上清液 分离。
  4. 一旦溶液变澄清，便小心清除和丢弃上清液。注意不要扰动含有 DNA 靶标的珠子。
  5. 在将试管/平板放在磁力架上时，将新鲜制备的 200 µl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除并丢弃上清液。注意不要扰动含有 DNA 靶标的珠子。
  6. 重复步骤 5 一次，洗涤总计两次。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体 。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让微珠风干长达 5 分钟。
    注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。 在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。 如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，以洗脱珠子上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温下孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。一旦溶液变澄清，便将 15 µl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集（第四部分）。（安全停止）或者，样品可在 -20°C 下保存。

四、对接头连接的 ChIP DNA 进行 PCR 富集

开始之前：

  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 中提供 Universal PCR Primer for Illumina Systems (•) 和十二种 Index Primers for Illumina Systems (•)。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一种 Index Primer。请参阅 #29580 说明书， 了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq ,CUT&RUN) #47538 中提供八种 Index 5 Primers for Illumina Systems（白色盖）和十二种 Index 7 Primers for Illumina Systems （橙色盖）。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用，则每次反应仅需使用一种 Index 5 primer 和一种 Index 7 primer。请参阅 #47538 说明书， 了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • 在室温下解冻引物和纯化的接头连接的 ChIP DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9 ）。
  1. 将以下组分添加到无菌 PCR 试管中：
    试剂 1 次 PCR 反应 所需的体积 (50 µl)
    纯化后的接头连接的 ChIP-DNA 片段 （源于第三部分中的步骤 9） 15 µl
    Q5 PCR Master Mix (•) 25 µl
    Single Index Primer for Illumina Systems (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 7 Primer for Illumina Systems [橙色盖]） 5 µl
    Universal PCR Primer for Illumina Systems (•) （或用于双重索引化的 Index 5 Primer for Illumina Systems [白色盖]） 5 µl
  2. 上下吹打 10 次以彻底混合反应物，并快速旋转一次 以收集试管壁上的所有液体。
  3. 将试管放在热循环仪上，并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增：
    a. 初始变性 98°C 30 秒
    b. 变性 98°C 10 秒
    c. 复性和延伸 65°C 15 秒
    d.

    如果起始物料为 50 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 6 次。
    如果起始物料为 5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 10 次。
    如果起始物料为 0.5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 13 次。

    e. 终末延伸 65°C 3 分钟
    f. 保持 4°C
  4. 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，样品可在 -20°C 下保存。

五、清除 PCR 扩增物

开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠子，则使这些珠子在使用前加温至室温至少 30 分钟 。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 为每份样品制备 400 µl 80% 乙醇。
  • 为每份样品制备大约 40 µl 的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)。
  1. 向第四部分步骤 4 的 50 µl PCR 反应中添加 45 µl (0.9X) 重悬的 AMPure XP 珠子或 SPRIselect 珠子。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中， 注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让珠子与上清液 分离。
  4. 小心清除和丢弃上清液。注意不要扰动含有 DNA 靶标的珠子。
  5. 在将试管/平板放在磁力架上时，将新鲜制备的 200 µl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除并丢弃上清液。注意不要扰动含有 DNA 靶标的珠子。
  6. 重复步骤 5 一次，洗涤总计两次。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体 。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让微珠风干长达 5 分钟。
    注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。 在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。 如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，以洗脱珠子上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温下孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 30 µl 含有 DNA 靶标的上清液 小心地转移到新试管中。（安全停止）可将文库保存在 -20°C 下。
  10. 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 文库的浓度应在 10-40 ng/µl 范围内。
  11. 使用 10mM Tris-HCl 将 1 µl 文库 DNA 稀释至最终浓度 5-10 ng/µl。根据制造商的说明， 利用 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA 芯片， 使用稀释的文库 DNA 确定大小分布。
  12. 如果观察到接头二聚物（对于 Single Index Primers 约为 128 bp，对于 Dual Index Primers 约为 146 bp）污染，则重复清除步骤 1-10。残留的接头和/或接头二聚物会严重污染 测序反应。
  13. 使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品，以进行高通量测序。请参阅 Illumina Systems 测序手册，了解 NG-seq 要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。
安全停止 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。

一、结束制备

进行 CUT&RUN-seq 时，必须生成一个对照 DNA 测序文库， 用于确定在 CUT&RUN 检测和 DNA 文库制备过程中引入的、 影响 DNA 富集的任何实验偏差。从输入 DNA 中纯化的 DNA（请参阅 CUT&RUN Assay Kit #86652 实验步骤的第六部分或 CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647 实验步骤的第七部分） 通常用于生成对照 DNA 文库。

起始物料：0.5 ng-1 µg CUT&RUN DNA。对于使用 100,000 个起始细胞的每个反应，CUT&RUN DNA 的典型产量为 0.6 至 6 ng。为了确保 DNA 测序文库的最佳多样性， 我们建议使用从一次 CUT&RUN 反应中能获得的尽可能多的 CUT&RUN DNA。如有必要， 可使用少至 0.1 ng 的 CUT&RUN DNA 进行文库生成；然而，由于扩增过程中存在 PCR 偏差， 这可能会导致文库的多样性程度较低。对于使用输入 DNA 的对照 DNA 测序文库， 5 - 10 ng 是一个良好起点。请注意，需要 Picogreen 测定法测定 CUT&RUN DNA 浓度， 因为单用 Nanodrop 并不足够灵敏。

开始之前：

  • 在室温下解冻 End Prep Reaction Buffer #93209 ( •)。 如果 DTT 析出，则涡旋混合。
  • 制备 1X TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)。
  1. 在独立的无菌无核酸酶管中制备 0.5-10 ng CUT&RUN DNA 和相关性输入 DNA （对照 DNA）。添加 1X TE，让每份 DNA 样品的最终体积为 50 µl。
  2. 向每份 DNA 样品中添加 3 µl End Prep Enzyme Mix ( •) 和 7 µl End Prep Reaction Buffer ( •)，使总反应体积为 60 µl。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物，并快速离心一次 以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会 干扰实验的进行。
  4. 放在热循环仪中，并进行以下流程：
    • 20 °C，30 分钟
    • 50 °C，30 分钟
    • 保持在 4 °C 下
  5. 继续进行接头连接（第二部分）。如有必要，将样品保存在 -20°C 下；但是， 可能会观察到产量略有下降（约 20%）。我们建议在停止之前继续进行接头连接 。

二、接头连接

开始之前：

  • Adaptor for Illumina Systems ( •) 和 USER 酶 (•) 均可在 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中找到。
  • 在室温下解冻 Adaptor for Illumina Systems ( •)。
  • 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。
  • 为每份样品制备大约 2.5 µl 的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)。
  1. 按照下表中的指示，使用 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 稀释 Adaptor for Illumina Systems (•)，以避免过量接头污染文库 DNA。
    起始 DNA 适配体稀释 适配体工作浓度
    100 ng - 1 µg 无稀释 15 µM
    5 ng - 100 ng 1:10 1.5 µM
    2.5 ng - 5 ng 1:25 0.6 µM
    1.25 ng - 2.5 ng 1:50 0.3 µM
    小于 1.25 ng 1:125 0.12 µM
  2. 将 30 µl Ligation Master Mix ( •)、1 µl Ligation Enhancer ( •) 和 2.5 µl 稀释的 Adaptor for Illumina Systems 直接加至 60 µl End Prep Reaction Mixture（源于第一部分的步骤 5）。
    注：不建议提前制备含有稀释接头的反应预混物 。但是，如果在 4°C 下放置 < 8 小时，则允许使用 Ligation Master Mix 和 Ligation Enhancer 的预混物。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合连接反应物，并快速旋转一次 以收集试管壁上的所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物的充分混合， 因为混合不完全会导致 连接效率降低。少量气泡并不会干扰 实验的进行。
  4. 在室温孵育至少 15 分钟。
  5. 向连接混合物添加 3 µl USER Enzyme ( •)。混匀并 在37°C 下孵育 15 分钟，加热盖设置为 ≥ 47°C。
  6. 继续清除接头连接的 CUT&RUN DNA（第三部分）。（安全停止）或者，将样品在 -20°C 下保存过夜。

三、清除接头连接的 CUT&RUN DNA，无需进行大小选择

在清除接头连接的 CUT&RUN DNA 的阶段，不建议进行大小选择， 因为它会导致 DNA 文库的产量和多样性急剧下降。

开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠子，则使这些珠子在使用前加温至室温至少 30 分钟 。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 为每份样品制备 400 µl 80% 乙醇。
  • 为每份样品制备 17 µl 的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)。
  1. 向每个接头连接反应添加 106 µl (1.1X) 重悬的 AMPure XP 珠子或 SPRIselect 珠子。 上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中， 注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让珠子与上清液 分离。
  4. 一旦溶液变澄清，便小心清除和丢弃上清液。小心去除所有液体残留物， 但不要扰动含 DNA 靶标的珠子。
  5. 在将试管/平板放在磁力架上时，将新鲜制备的 200 µl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除并丢弃上清液。注意不要扰动含有 DNA 靶标的珠子。
  6. 重复步骤 5 一次，洗涤总计两次。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体 。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让微珠风干长达 5 分钟。
    注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。 在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。 如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，以洗脱珠子上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温下孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。一旦溶液变澄清，便将 15 µl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集（第四部分）。（安全停止）或者，样品可在 -20°C 下保存。

四、PCR 富集接头连接的 CUT&RUN DNA

开始之前：

  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 中提供 Universal PCR Primer for Illumina Systems ( •) 和十二种 Index Primers for Illumina Systems ( •)。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一种 Index Primer。请参阅 #29580 说明书， 了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq ,CUT&RUN) #47538 中提供八种 Index 5 Primers for Illumina Systems（白色盖）和十二种 Index 7 Primers for Illumina Systems （橙色盖）。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用，则每次反应仅需使用一种 Index 5 primer 和一种 Index 7 primer。请参阅 #47538 说明书， 了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • 在室温下解冻引物和纯化的接头连接的 CUT&RUN DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9） 。
  1. 将以下组分添加到无菌 PCR 试管中：
    试剂 1 次 PCR 反应所需的体积 (50 µl)
    纯化后的接头连接的 CUT&RUN-DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9） 15 µl
    Q5 PCR Master Mix ( •) 25 µl
    Single Index Primer for Illumina Systems ( •)（或用于双重索引化的 Dual Index 7 Primer for Illumina Systems [橙色盖]） 5 µl
    Universal PCR Primer for Illumina Systems (•) （或用于双重索引化的 Index 5 Primer for Illumina Systems [白色盖]） 5 µl
  2. 上下吹打 10 次以彻底混合反应物，并快速旋转一次 以收集试管壁上的所有液体。
  3. 将试管放在热循环仪上，并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增：
    a. 初始变性 98°C，30 秒
    b. 变性 98°C，10 秒
    c. 复性和延伸 65°C，13 秒
    d. 对于 50 - 100 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，共循环 6 - 7 次
    对于 5 - 50 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，共循环 8 - 12 次
    对于 1 - 5 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，共循环 13 - 15 次
    对于 0.5 - 1 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，共循环 16 - 17 次
    对于 0.2 - 0.5 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，共循环 18 - 19 次
    对于 0.1 -0.2 ng 起始 CUT&RUN DNA 重复步骤 b 和 c，共循环 20 次
    e. 终末延伸 65°C，3 分钟
    f. 保持 4°C

     

  4. 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，样品可在 -20°C 下保存。

五、清除 PCR 扩增物

开始之前：

  • 如果使用 AMPure XP 珠子，则使这些珠子在使用前加温至室温至少 30 分钟 。
  • 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
  • 为每份样品制备 400 µl 80% 乙醇。
  • 为每份样品制备大约 40 µl 的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)。
  1. 向第四部分步骤 4 的 50 µl PCR 反应中添加 50 µl (1.0X) 重悬的 AMPure XP 珠子或 SPRIselect 珠子 。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中， 注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让珠子与上清液 分离。
  4. 小心清除和丢弃上清液。小心去除所有液体残留物， 但不要扰动含 DNA 靶标的珠子。
  5. 在将试管/平板放在磁力架上时，将新鲜制备的 200 µl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除并丢弃上清液。注意不要扰动含有 DNA 靶标的珠子。
  6. 重复步骤 5 一次，洗涤总计两次。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体 。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让微珠风干长达 5 分钟。
    注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。 在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。 如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，以洗脱珠子上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温下孵育至少 2 分钟。
    注：如果需要更高浓度的文库 DNA，可以使用更少体积的 Tris-HCl (pH 8.0-8.5) （例如 17 µl）。
  9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 30 µl 含有 DNA 靶标的上清液 小心地转移到新试管中。（安全停止）可将文库保存在 -20°C 下。
    注：如果步骤 8 中使用 17 µl 的 Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，则仅转移 15 µl 含 DNA 靶标的上清液至一个新管中 。
  10. 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 文库的浓度应在 10-40 ng/µl 范围内。
  11. 使用 10mM Tris-HCl 将 1 µl 文库 DNA 稀释至最终浓度 5-10 ng/µl。根据制造商的说明， 利用 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA 芯片， 使用稀释的文库 DNA 确定大小分布。
  12. 如果观察到接头二聚物（对于 Single Index Primers 约为 128 bp，对于 Dual Index Primers 约为 146 bp）污染，则重复清除步骤 1-10。残留的接头和/或接头二聚物会严重污染 测序反应。
  13. 使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品，以进行高通量测序。请参阅 Illumina Systems 测序手册，了解 NG-seq 要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。

附录 A：试剂盒组分的质量控制

一. End Prep Enzyme Mix (•)

描述
End Prep Enzyme Mix 经过优化,可将 500 pg-1 µg 的片段化 DNA 转化为具有 5´--磷酸化、3´-dA 加尾的末端的已修复 DNA。

质量控制检测

  1. SDS-PAGE 纯度：对每个单独的酶进行的 SDS-PAGE 分析显示，酶纯度 > 95%。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 µl 反应体积中加入至少 10 µl 这种酶混合物和 1 µg φX174 RF I DNA ，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时， 经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 磷酸酶活性：将至少 10 µl 这种酶混合物加入含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶检测缓冲液 （1 M 二乙醇胺，pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中，在 37°C 下孵育 4 小时， 经分光光度计分析确定在 405 nm 处检测不到对硝基苯阴离子。
  4. 功能活性（核苷酸掺入、磷酸化和 dA 加尾）：在 1X End Repair Reaction 缓冲液中加入 1 µl 这种酶混合物， 在 25°C 下孵育 20 分钟，经毛细管电泳确定，可修复和磷酸化 0.5ug 同时含 3´ 和 5´ 突出末端的 DNA 片段的 > 95% 末端 。

二、End Prep Reaction Buffer (•)

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：将含有 1X 浓度的这种反应缓冲液和 1 µg HindIII 酶切 λ DNA 的 50 µl 反应体系在 37°C 下孵育 16 小时， 经琼脂糖凝胶电泳确定，未发现可检测的非特异性核酸酶降解。 将含有 1X 浓度的这种反应缓冲液和 1 µg T3 DNA 的 50 µl 反应体系在 37°C 下孵育 16 小时， 经琼脂糖凝胶电泳确定，也未发现可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：将 1X 浓度的这种反应缓冲液与 1 µg φX174 RF I DNA 在 50 µl 反应体系中于 37°C 下孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定， RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：将 1X 浓度的这种反应缓冲液和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定，没有可检测的 RNase 活性。
  4. 磷酸酶活性：将 1X 浓度的这种反应缓冲液加入含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶检测缓冲液 （1 M 二乙醇胺，pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中， 在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处检测不到 对硝基苯阴离子。

三、Ligation Master Mix (•)

描述
Ligation Master Mix 是一种即用型溶液，包含 T4 DNA 连接酶、专有连接增强子以及 优化的反应缓冲液。

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：将含有 1X 浓度的 Ligation Master Mix 和 1 µg HindIII 酶切 λ DNA 的 50 µl 反应体系在 37°C 下孵育 16 小时， 经琼脂糖凝胶电泳确定，未发现可检测的非特异性核酸酶降解。 将含有 1X 浓度的 Ligation Master Mix 和 1 µg T3 DNA 的 50 µl 反应体系在 37°C 下孵育 16 小时， 经琼脂糖凝胶电泳确定，也未发现可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：将 1X 浓度的 Ligation Master Mix 与 1 µg φX174 RF I DNA 在 50 µl 反应体系中于 37°C 下孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定， RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：将 1X 浓度的 Ligation Master Mix 和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定，没有可检测的 RNase 活性。
  4. 转化测定：将 LITMUS 28 载体用 EcoRV（平端）切割，用牛小肠磷酸酶处理并且 进行凝胶纯化。使用 Ligation Master Mix 实验步骤，将 HaeIII 酶切 φX174 DNA 产生的钝性插入物以 3:1（插入物:载体）的比例连接至载体中。连接产物 按之前所述转化。每一批均超过以下标准：

效率（转化物/µg）

重新环化 插入
钝端 > 1 x 107 > 2.5 x 106
未切割的载体 > 1 x 108 N/A

四、Ligation Enhancer (•)

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：将含有 1 µl Ligation Enhancer 和 1 µg µHindIII 酶切 λ DNA 的 50 µl 反应体系在 37°C 下孵育 16 小时， 经琼脂糖凝胶电泳确定，未发现可检测的非特异性核酸酶降解。将含有 1 µl NEBNext 5' SR Adaptor 3 和 1 g T3 DNA 的 50 µl 反应体系在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定， 未发现可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 µl Ligation Enhancer 和 1 µg φX174 RF I 超螺旋化 DNA 的 50 µl 反应在 37°C 下孵育 4 小时导致向 RF II（带切口的分子 ）转化低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 µl Ligation Enhancer 和 40 ng RNA 转录物的 10 µl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检测的 RNA 降解。
  4. 磷酸酶活性：将 1 µl Ligation Enhancer 加入含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺，pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处检测不到对硝基苯阴离子 。

五. Q5 PCR Master Mix (2X) (•)

描述
Q5 PCR Master Mix (2X) 经过专门优化，可对下一代测序分析 (NGS) 文库进行稳健、高保真的扩增，无论 GC 含量如何。主混合物的聚合酶组分 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 是一种新型的 DNA 耐热聚合酶，它具有 3´→5´ 核酸外切酶活性，可融合至一个持续合成能力增强的 Sso7d 结构域。Q5 的错误率也超低 （比 Taq DNA 聚合酶的错误率 > 100 倍，比强烈火球菌 (Pfu) DNA 聚合酶低大约 12 倍） 。主混合物的缓冲液组分经过优化，可用于实现可靠扩增，即使对富含 GC 的扩增子也是如此，并且对各种用于典型 NGS 工作流程的珠子具有更高的适用性。这些功能使得 Q5 PCR Master Mix 理想用于 NGS 文库构建。这种便利的 2X 主混合物包含 dNTPs、Mg++ 以及专有缓冲液，并且仅需添加引物和 DNA 模板即可进行可靠扩增。内含热启动适配子，允许在室温下方便地进行 反应设置。

质量控制检测

  1. 16 小时孵育：将含有 Q5 PCR Master Mix 和 1 µg HindIII 酶切 λ DNA 的 50 µl 反应体系在 37°C 下孵育 16 小时， 经琼脂糖凝胶电泳确定，未发现可检测的非特异性核酸酶降解。将含有 Q5 PCR Master Mix 和 1 µg T3 DNA i 的 50 µl 反应体系在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定， 未发现可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 磷酸酶活性：将 Q5 PCR Master Mix 加入含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺，pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处检测不到对硝基苯阴离子。
  3. 功能活性（多重 PCR，珠子抑制）：在含有 0.5 µM 4-plex 引物混合物和 1X Q5 PCR Master Mix 的 50 µl 反应中使用和不使用羧化磁珠时 20 ng 基因组 DNA 的 30 次 PCR 扩增循环产生四个预期的扩增子， 且在磁珠存在时不抑制扩增。

2017 年 11 月发布

2026 年 1 月修订

实验步骤编号：1624