ELISA-肽测定法实验步骤

A. 溶液与试剂

1. 碳酸盐缓冲液：15 mM Na₂CO₃、35 mM NaHCO₃、0.2 g/L NaN₃ (pH 9.6)。将 1 μM 合成肽溶于碳酸盐缓冲液中。
2. 10X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：要配制 1 l，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4 g 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄) 和 2.4 g 磷酸一氢钾 (KH₂PO₄) 到 1 L dH₂O 中。将 pH 值调节至 7.4。
3. 洗涤缓冲液：含有 0.05% Tween-20 的 1X PBS (PBST)
4. 封闭液：用 PBST 稀释的 10 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA)。
5. 抗体稀释缓冲液：用 PBST 稀释的 3% BSA
6. DELFIA^® 铕标记的针对小鼠一抗的 Anti-mouse IgG 或针对兔一抗的 Anti-rabbit IgG (PerkinElmer Life Sciences #AD0124)。
7. DELFIA^® Enhancement Solution (PerkinElmer Life Sciences #1244-105)

（DELFIA^® 是 PerkinElmer, Inc. 的注册商标）

B. 实验步骤

1. 对于 96 孔微滴定平板的各孔，用碳酸盐缓冲液配制的 100 μl 1 μM 合成肽包被，在 4°C 下孵育过夜，或在 37°C 下孵育 2 至 6 小时。如果肽不结合或不吸附，可尝试 pH 在 4–8 内的其他缓冲液。
2. 用 200 µl/孔的洗涤缓冲液洗涤平板 3 次。
3. 在 37°C 下用 200 µl/孔封闭液封闭平板 1 小时。用洗涤缓冲液洗涤平板 3 次。（如果需要，可以持续 1–2 个月将干燥平板保持在 4°C。）
4. 用抗体稀释缓冲液配制适宜稀释度的一抗。向每个孔中添加 100 µl，并在 37°C 下孵育 1 小时。
5. 用洗涤缓冲液洗涤 3 次。
6. 按 67 ng/孔添加用 100 µl/孔抗体稀释缓冲液稀释的 DELFIA 铕标记 Anti-mouse IgG 或 Anti-rabbit IgG。在轻柔振荡摇床上室温孵育 30 分钟。
7. 用洗涤缓冲液洗涤 3 次。
8. 添加 100 μl 增强溶液并在室温下孵育 5 分钟。用适宜的时间分辨平板读数仪在 615 nm 读取平板读数。