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免疫沉淀法实验设计提示

免疫沉淀法 (IP) 是指从不均一的细胞或组织提取物中使用靶标特异性抗体富集特定蛋白质的一项技术。免疫共沉淀 (co-IP) 是完整蛋白质复合体的沉淀过程。IP 和 co-IP 是广泛运用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质复合体中新成员的一项重要技术。虽然 IP 技术相对简单,但涉及众多变量,并且纳入恰当实验对照对优化和 IP 结果准确解读至关重要。

输入对照

应纳入完整裂解物对照,以确保实验的蛋白质印迹部分正常工作。如果完整裂解物对照中见到靶标信号,但 IP 样品中未见,则表明抗体工作正常,但是,IP 富集可能失败。

同型对照

同型对照是实验中必要的阴性对照。IP 实验中使用的同型对照应匹配一抗的 IgG 亚类。兔只有一个 IgG 亚类,因此选择同型对照相对简单。我们建议 Normal Rabbit IgG #2729 用于采用兔多克隆抗体的实验,及Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于采用兔单克隆抗体的实验。

当使用小鼠中产生的一抗时,同型对照选择更复杂,因为小鼠有五个 IgG 亚类:IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3。具体 CST 抗体的亚类可在来源/同种型部分中产品网页上找到。CST 提供以下同型对照匹配我公司小鼠一抗:

同型对照应浓度匹配,并在蛋白质印迹法期间与一抗样品并排运行。

单一珠对照

单一珠对照在 IP 实验中充当珠的附加阴性对照,并且涉及将珠添加到没有任何抗体存在的裂解物样品中。如果您在 IgG 同型阴性对照和/或 IP 实验中遇到非特异性结合,可能需要添加单一珠对照。

CST 为 IP 实验提供以下珠类型:

实验设计

我们建议如下设置实验:

  1. 针对以下 4 种条件中每者准备试管:输入、同型对照(浓度匹配)、唯一珠对照和抗体(按建议的稀释度)。
  2. 将 50 μl 裂解物添加到“输入”试管中,并将 200 μl 裂解物添加到其他每个试管中。保持“输入”试管在冰上,并遵循我们为其他试管(即同型对照、仅微珠对照和抗体)推荐的 IP 实验步骤。
  3. 将 25 μl 3X 还原性 SDS 上样缓冲液添加至“输入”试管,并通过将珠沉淀物重悬于 30 μl 3X 还原性 SDS 样品缓冲液中,洗脱剩余样品。
  4. 将样品(包括“输入”样品)加热到95- 100C 持续 2-5 分钟。以 14,000 x g 微量离心 1 分钟,并保存 IP 洗脱液。
  5. 将 15 μl 每个输入样品和 IP 洗脱液样品上样到凝胶上,然后通过蛋白质印迹法分析。

如果您的 IP 实验未以按计划进行告终,请访问免疫沉淀法疑难解答指南寻求额外支持或联系技术支持

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