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免疫沉淀法疑难排解指南

精心策划的实验,具有适当的控制、处理和条件,通常是获得改进结果的第一步。要更多了解免疫沉淀 (IP) 实验计划,请查看我们的免疫沉淀实验指南

问题

问题 可能的原因 讨论 建议
信号低/无信号 蛋白质-蛋白质相互作用遭苛刻裂解条件破坏 如果您的 co-IP 实验中未见信号,则所用的裂解缓冲液可能破坏蛋白质-蛋白质相互作用。虽然 Cell Lysis Buffer #9803RIPA Buffer #9806 都适合生成全细胞提取物用于蛋白质印迹法,但我们仅推荐 #9803 Cell Lysis Buffer 用于 IP 或 co-IP 实验。RIPA 缓冲液被视为一种更强的变性缓冲液,因为它含有离子型去垢剂脱氧胆酸钠。这种去垢剂有助于破坏核膜并进一步溶解细胞组分和膜组分,同时防止蛋白质降解且不干扰免疫反应性。已知 RIPA 缓冲液使激酶变性并防止蛋白质-蛋白质相互作用,因此不适用于 co-IP。

存在许多可能影响分析测结果的所涉因素,如相关蛋白质相互作用的强度,而研究人员往往可能需要调整其实验条件以获得最佳结果。Cell Lysis Buffer #9803 ,连同我公司建议用于 IP 的实验步骤一起将充当进行 Co-IP 的合适起点。
请谨记,使用上述任一种裂解缓冲液时,超声处理至关重要。它将确保充分的胞核破裂、DNA 剪切,并将导致蛋白质回收可能最大。超声处理对提取核蛋白和膜蛋白尤为重要,并且不会破坏大多数蛋白质复合体。

纳入输入裂解物对照,以确保靶标蛋白按高到足以在您的样品中检出的水平表达并且确保针对您的目的靶标的抗体一直正常工作。

用针对您的 IP 蛋白的抗体探测印迹物,以确保 IP 实验有效并且确保您成功沉淀出主要蛋白质。

  组织或细胞系中的蛋白表达水平低 如果您的 IP 实验中未见信号,则 IP 蛋白或相互作用性目的蛋白可能可能按蛋白质印迹法检出水平以下的水平表达。

使用表达谱分析工具如 BioGPSHuman Protein Atlas 以及科学文献来核查细胞或动物组织是否预计充分表达目的靶标蛋白。我们始终建议设置已知的阳性对照,以判断实验结果。如需了解我们许多抗体的推荐对照信息,请参阅我们靶标的阳性对照处理表

纳入输入裂解物对照,以确保靶标蛋白按高到足以在您的样品中检出的水平表达并且确保针对您的目的靶标的抗体一直正常工作。

  磷酸化或修饰蛋白的水平低 在细胞系或组织中,许多翻译后修饰的蛋白质按低下基础水平表达。某些靶标可能需要用化学调节剂额外处理或特定条件下生长,以便按高到足以进行蛋白质印迹检测的水平表达。

我们建议使用 PhosphoSitePlus 查找与您特定修饰位点有关的使用低通量方法的文献,或使用我们靶标阳性对照处理表查找处理方法以及可作为阳性对照的细胞系或组织。

细胞提取物中包含磷酸酶抑制剂对维持蛋白磷酸化至关重要。应将焦磷酸钠(最终浓度为 2.5 mM)和 β-甘油磷酸盐(最终浓度为 1.0 mM)作为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂加入裂解缓冲液中。应加入正钒酸钠(最终浓度为 2.5 mM)以抑制酪氨酸磷酸酶。还可以使用 Phosphatase Inhibitor Cocktail #5870Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail #5872

纳入输入裂解物对照,以确保靶标蛋白按高到足以在您的样品中检出的水平表达并且确保针对您的目的靶标的抗体一直正常工作。

  表位掩蔽 表位掩蔽是指靶标 IP 蛋白上抗体的结合位点被天然条件下靶标的构象或其他相互作用性蛋白所掩盖,从而导致阴性 IP 结果。 如果怀疑存在表位掩蔽,最好尝试一种识别靶标蛋白不同区域内表位的抗体。可以在抗体产品页面的“来源/纯化”部分下找到关于 CST 抗体的表位区域信息。
 
  IgG 与珠子的结合作用低 虽然蛋白 A 珠和蛋白 G 珠均可成功配合兔和小鼠抗体使用,但 CST 建议配合兔抗体工作时使用蛋白 A 珠,而配合小鼠抗体工作时使用蛋白 G 珠。这归因于蛋白 A 珠对兔 IgG 具有较高亲和力,而蛋白 G 珠对小鼠 IgG 具有较高亲和力。 根据正用于 IP 的抗体的宿主物种优化珠子选择。组合蛋白 A/G 珠也可能有助于增加 IgG 结合。
 
多个条带或非特异性结合 脱靶蛋白质与珠或 IgG 对照非特异性结合 如果您的 IP 实验中观察到非特异性背景信号,则这可能由脱靶蛋白质与珠上蛋白 A 或 G 结合引起或直接由 IgG 引起。

单一珠对照充当额外的阴性对照,以考虑 IP 实验内部任何非特异性蛋白质-珠相互作用。如果单一珠对照实验中观察到背景,则可能需要预先清理裂解物。在 IP 实验之前,通过将裂解物与单一珠在 4°C 孵育 30-60 分钟进行预先清理。

也可纳入同型对照,以显示背景是否由蛋白质非特异性结合于 IP 抗体的 IgG 导致。

  同工型反应性或翻译后修饰

某些细胞系和组织模型可以包含多种蛋白同工型或剪接变体,它们可以迁移至不同的分子量。

翻译后修饰 (PTM) 会导致部分靶蛋白的电泳速率与未修饰蛋白不同。糖基化、SUMO 化、泛素化和磷酸化便是修饰的例子,这些修饰可能导致蛋白印迹上出现多个条带,具体取决于使用的样品和处理方法。

纳入输入裂解物对照,以确定额外条带是否由结合于抗体引起。请参阅抗体网页上的“特异性/灵敏度”部分,确定是否能预测检测或确认检测到多种同工型。还可以在 UniProt 上查阅目的蛋白,看看是否列出了多个同工型序列。

如果您正在查找更多靶蛋白相关的 PTM 信息,请参阅 PhosphoSitePlus

如果输入对照中未观察到背景,则来源可能归因于蛋白质与珠或 IgG 的非特异性结合。在这种情况下,将需要单一珠对照同型对照来确定额外条带的原因(参见以上部分)。

靶标信号遭 IgG 掩蔽 靶标信号遭重链或轻链 IgG 掩盖 当进行 IP 接着进行蛋白质印迹时,用于 IP 的一抗的变性 IgG 轻链和重链在蛋白质印迹物上分别定位在约 25 和 50 kDa 处,并且往往可能掩盖分子量相似的靶标蛋白条带。来自同一宿主动物的抗体既用于 IP 又用于蛋白质印迹法是导致此结果的原因。蛋白质印迹法中所用的二抗不仅检出用于一抗孵育的天然 IgG,还检出用于 IP 的抗体的变性重链与轻链。

有几种方法避免这种后果:

来自不同物种的抗体用于 IP 和蛋白质印迹法。例如,兔抗体用于 IP 而小鼠抗体用于蛋白质印迹法,或反之亦然。请注意,二抗需有物种特异性。我们的检验已经用 Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody #7074Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody #7076 进行,这些抗体分别对兔和小鼠高度特异。我们未随这些二抗观察到物种交叉反应性。

来自相同物种的生物素化一抗用于蛋白质印迹法。然后可以使用不会与变性 IgG 交叉反应的 Streptavidin-HRP #3999 检测生物素化抗体。

如果您的靶标在 25 kDa 附近没有迁移,则可以使用轻链特异性二抗。CST 提供 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate) #93702Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) #58802

使用优先结合天然 IgG 的我公司 Protein A (HRP Conjugate) #12291 替换蛋白质印迹法中的二抗。但是,重点提示,#12291 可能与高浓度的变性 IgG 交叉反应。

构象特异性二抗用于蛋白质印迹法。CST 提供优先结合天然构象下 IgG 的 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #5127。但是,重点提示,#5127 也可能与高浓度的变性 IgG 交叉反应。

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