我们有一个新的 URL!www.cellsignal.cn | 点击了解更多 >>
5127
Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate)
二抗
二抗

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127

引用 (95)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1 - Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate)

使用 PRAS40 (D23C7) XP® Rabbit mAb #2691(泳道 2)对 HeLa 细胞的 PRAS40 进行免疫沉淀。泳道 1 为输入的对照裂解物。将 PRAS40 (D23C7) Rabbit mAb #2691 用作一抗来检测所有泳道。二抗包括 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074(小图 A)和 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127(小图 B)。

Western Blotting Image 2 - Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate)

使用 Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb #3495(泳道 2)对 HeLa 细胞的 Beclin-1 进行免疫沉淀。泳道 1 为输入的对照裂解物。将 Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb #3495 用作一抗来检测所有泳道。二抗包括 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074(小图 A)和 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127(小图 B)。

购买 # 5127S
产品货号 规格 价格 库存
5127S
100 µl

支持数据

反应性
敏感性
MW (kDa)
来源/亚型 小鼠 

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

经亲和纯化的 mouse anti-rabbit IgG (Conformation Specific) HRP Conjugate antibody。

产品使用信息

推荐的抗体稀释度:

1:2000

保存

保存在 136 mM NaCl、2.6 mM KCI、12 mM 磷酸氢二钠 (pH 为 7.4) 、2 mg/ml BSA 和 50 % 甘油中。存储温度为 -20℃。切勿分装抗体。

实验步骤

打印

查看 > 折叠 >

蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/敏感性

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) 可识别天然兔 IgG。它在蛋白质印迹实验中不会识别变性和还原的兔 IgG 重链(约 50 kDa)或轻链(约 25 kDa)。

来源/纯化

使用总天然兔 IgG 对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb 仅会与天然 IgG 发生反应,并且不会结合变性和还原的兔 IgG 重链或轻链。进行免疫沉淀 (IP) 后再进行蛋白质印迹实验时,用于进行免疫沉淀的一抗的变性兔 IgG 轻链和重链在随后的蛋白质印迹实验中分别约为 25 和 50 kDa,并且通常会掩盖分子量相似的蛋白条带。Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb 用作二抗可避免这个问题。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink