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CAR-T 疗法研究工具:更快发现有效疗法

嵌合抗原受体 (CAR) T 疗法是一种颠覆类型的过继细胞免疫疗法,它采用基因工程来使细胞毒性 T 淋巴细胞的特异性重定向到肿瘤细胞表面上表达的肿瘤抗原。已展现 CAR-T 疗法明显成功治疗血液系统恶性肿瘤面,并可能潜在地用于安全治疗实体瘤和衰老疾病,例如肝纤维化病和糖尿病。已经将1-3 CAR- T 免疫疗法描述为可能在单次输注后数十年有效的活疗法。

CAR-T 开发工作流程是一个确保开发安全、有效治疗方法的多步骤过程。Cell Signaling Technology® (CST) 提供产品解决方案,以辅助临床前研究鉴定和选择靶标、CAR-T 细胞表征以及询问患者对疗法的反应。

CAR-T 开发工作流程

 

步骤 1 步骤 2 步骤 3 步骤 4

第 1 步:

肿瘤抗原发现和验证

第 2 步:

scFv 筛选和优化

第 3 步:

CAR 转基因构建

第 4 步:

CAR 转基因递送

步骤 5 步骤 6 步骤 7  

步骤 5:

分析以
表征 CAR-T 细胞

步骤 6:

临床前体内测定法

步骤 7:

患者选择和监测

 

 

肿瘤抗原发现和验证的最终目标是找到这样的肿瘤表面抗原,它们在大多数肿瘤细胞上表达;显示一种最大限度降低肿瘤脱靶毒性风险的表达模式,并且稳定表达,从而靶标损失将不会导致治疗无效。鉴定新肿瘤抗原的挑战性足够大,而不必担心您正在使用的抗体是否具有特异性或是否足够灵敏以检出潜在的肿瘤抗原。您需要使用可以信赖的可靠抗体,以便每次都准确检出肿瘤靶标蛋白。CST 抗体接受苛刻的内部应用专用验证,让您确信自己的检测试剂特异、可靠和亲和力高。

从检测样品中已知肿瘤抗原的高度特异性抗体开始:

使用 CD19 (Intracellular Domain) (D4V4B) XP® Rabbit mAb #90176 对石蜡包埋的人淋巴瘤组织进行免疫组织化学分析。

使用 TNFRSF17/BCMA (E6D7B) Rabbit mAb #88183 对石蜡包埋的人正常结肠组织进行免疫组织化学分析。

IHC 验证的抗体或流式细胞术验证的抗体偶联物:

使用 TNFRSF8/CD30 (E7E4D) XP® 兔单克隆抗体 (Alexa Fluor® 488 偶联物)(实线)或浓度匹配的兔 (DA1E) 单克隆抗体 IgG XP® 同型对照 (Alexa Fluor® 488 偶联物) #2975(虚线)对 HeLa 细胞(蓝色)和 KARPAS-299 细胞(绿色)进行流式细胞分析。KARPAS 细胞系来源:剑桥大学 Abraham Karpas 博士。

使用 IL-13RA2/CD213a2 (E7U7B) Rabbit mAb #85677对石蜡包埋的人多形性胶质母细胞瘤组织进行免疫组织化学分析。

工程化 CAR-T 细胞后,您需要通过监测 CAR 表面表达、细胞毒性和增殖来核实工程化的细胞是否具有功能。以下已验证的即用型仪试剂盒和试剂可帮助您表征工程化 CAR-T 细胞的功能:

 

功能测定法

增殖检测

CAR-T 细胞响应接合肿瘤抗原而增殖的能力是 CAR-T 细胞功能的重要读出。4用 CST 增殖测定法评估您 CAR-T 细胞增殖的能力Cell Proliferation Tracer Kit 使用流式细胞术监测随每次细胞分裂被稀释的荧光示踪剂染料。

在4天(d0-d3)的过程中跟踪 Jurkat 活细胞的细胞分裂。将细胞在第 0 天用 Cell Proliferation Tracer Kit(荧光检测,紫罗兰色 450)#48444 标记,并每天通过流式细胞术分析。每个相继较暗的峰代表一个细胞分裂。未染色的细胞由无阴影峰表示。

在4天(d0-d3)的过程中跟踪 Jurkat 活细胞的细胞分裂。将细胞在第 0 天用 Cell Proliferation Tracer Kit(荧光检测,蓝色 520)#53452 标记,并每天通过流式细胞术分析。每个相继较暗的峰代表一个细胞分裂。未染色的细胞由无阴影峰表示。

细胞毒性测定法

细胞溶解测定通常用于确定免疫效应细胞功能。使用不使用放射性同位素的敏感试剂盒调查细胞介导的细胞毒性。

确定 LDH 细胞毒性测定法的最佳细胞数:使用含有 10% FBS 的培养基,将 HeLa 细胞以不同密度接种到 96 孔板中。孵育过夜后,用无血清培养基替换细胞,然后用测定缓冲液(自发 LDH 释放)或 10% Triton X-100 溶液(最大 LDH 释放)处理。处理后,除去培养基并放入新的 96 孔板中。使用 LDH 细胞毒性测定试剂盒实验步骤确定释放到培养基中的 LDH 量。

表型分析用和功能标记物抗体

使用免疫表型分析用抗体,探索免疫系统在肿瘤学中的作用。免疫组织化学 (IHC) 和流式细胞术等应用允许多重监测细胞群,并且都要求严格的验证原则。

对 T 细胞亚群作表型分析以了解哪些亚群对工程化最有效,或对 CAR-T 细胞作表型分析以解 CAR 对表型和功能有什么影响。

探索针对组织或液态活检样本分析优化的免疫表型和功能标记全面目录。

使用 Phospho-SLP-76 (Ser376) (E3G9U) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate) #76143 和共染色的 CD3 (UCHT1) Mouse mAb (FITC Conjugate) #86774 ,对未经处理(左图)或经交联抗 CD3 + 抗 CD28(各 10 μg/ml,15 分钟;右图)处理的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。

与浓度匹配的 Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (violetFluor 450 Conjugate) #40282(虚线)比较,使用 CD3 (UCHT1) Mouse mAb (violetFluor 450 Conjugate) #61347(实线),对活的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。

确认 CAR 表达

除用于检测您感兴趣的 CAR 靶蛋白的已验证抗体外,CST 还提供用于验证 CAR 表面表达的试剂。如果您设计了包含 κ 轻链序列的 scFv,则使用 Protein L 监测 CAR 表面表达。

Protein L (PE Conjugate) #58036

CAR 信号转导分析

监测与 T 细胞行为相关的多种蛋白质的激活状态,以优化 CAR 功能。CST 提供针对相关信号通路中诸靶标的多种抗体,从而使您能够评估下游结果并更好了解 CAR-T 细胞行为。查看 CAR 信号转导网络通路和其他按研究领域划分的通路

为了全面调查 CAR 接合的磷酸化蛋白质组,CST 提供用于定性和定量蛋白质组学剖析的 Proteomics Analytical Services。我们的专家随时准备与您合作,从规划到交付综合数据包。探索我们的Proteomics Analytical Services产品。

契合您需求的定制化 CST 试剂

定制偶联服务

没有看到您需要的流式细胞术抗体偶联物?没问题!请利用我们在偶联抗体方面的专业知识。我们会将您需要的抗体与您选择的荧光物质偶联,从而您可以灵活设计自己想要的检测定法。使用我公司应用于所有 CST 抗体的相同标准,对定制的抗体偶联物验证、优化和测试稳定性。

请在此处订购您的定制抗体偶联物

定制抗体制剂

提供您所青睐抗体的无载体和定制化制剂,因此您可以进行不含 BSA、甘油或叠氮化物的 CAR-T 表征分析。您选择的抗体在 PBS 中提供,可最佳用于以下应用中:

  • ELISA 样测定法,例如 AlphaLISA®、HTRF® 和 MSD 测定法
  • 用于 CyTOF® 质谱流式细胞术、Imaging Mass Cytometry (IMC) 和 MIBI 的金属标记
  • 寡核苷酸标记
  • 生物素偶联
  • 用于流式分析和免疫荧光的荧光物质
  • 体内 和功能测定

探索我们的即用型、无载体抗体列表。

申请 CST 目录抗体的定制制剂

为了确定患者是否符合接受特定 CAR-T 疗法的资格,肿瘤抗原表达确认通常是临床试验选择的标准之一。此外,在整个治疗过程监测靶抗原表达是评估治疗效力的关键参数。

CST 提供这些及更多已充分验证的抗体,以按可重复方式帮助检测肿瘤抗原:

  1. CAR T 细胞疗法:癌症治疗新时代。Mohanty 等人Oncol Rep. 2019, 42(6):2183-2195。
  2. A Fresh Approach to Targeting Aging Cells: CAR-T Cells Enhance Senolytic Specificity. Li JH 和 Chen YY。Cell Stem Cell. 2020, 27(2): 192–194.
  3. Regulatory T Cells Engineered with a Novel Insulin-Specific Chimeric Antigen Receptor as a Candidate Immunotherapy for Type 1 Diabetes. Tenspolde M 等人J Autoimmun. 2019, 103:102289
  4. In vitro Tumor Cell Rechallenge for Predictive Evaluation of Chimeric Antigen T Cell Antitumor Function. Wang D 等人J Vis Exp. 2019, (144):10.3791/59275.

仅供研究使用。不得用于任何治疗用途的诊断。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。

所有其他商标均属各自所有者专有。访问 cellsignal.com/trademarks 以了解更多信息。

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