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CUT&RUN 常见问答

问题

解答

单个 CUT&RUN 测定中是否可使用最多数量的细胞?

我们发现每种测定法 100,000 细胞足以富集多种基因组修饰、转录因子和转录辅因子的靶基因座。然而,可以在不扩大珠、抗体或缓冲液的情况下将每个测定的细胞数量增加到 250,000。

在与 CUT&RUN 检测试剂盒的反应中,我可以使用的最少细胞数是多少?

我们已经证明,我们的 CUT&RUN 分析试剂盒 #86652可以与 12,500 细胞一样用于某些组蛋白修饰、转录因子和辅因子(参见图片)。但是,我们不能保证该试剂盒能在如此少量的细胞中适用于所有靶标蛋白。

CUT&RUN 分析信号的标准化

CUT&RUN 分析信号的标准化: 使用因 qPCR 分析而加入的 DNA 对 CUT&RUN 检测信号进行标准化。使用 CUT&RUN Assay Kit #86652、数量减少的 HCT 116 细胞与 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751(上图)或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499(下图)进行 CUT&RUN 检测。使用 SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653SimpleChIP® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中的免疫沉淀 DNA 数量表示为与输入染色质总量(100,000 个细胞的输入百分比)相对应的信号。左图中为非标准化的富集结果。在每次反应中,按照与起始细胞数量成比例的方式添加 Sample Normalization Spike-In DNA。根据每份样品中添加 DNA 所产生的 qPCR 信号差异,将 CUT&RUN 信号标准化为含 100,000 个细胞的样品。右图显示了标准化后的富集。

您是否观察到不同细胞系之间的测定性能有任何差异?

我们已对数十种培养的贴壁和悬浮细胞系(包括人和小鼠)进行了 CUT&RUN 分析。到目前为止,我们还没有注意到这些细胞系之间的性能有任何显著差异。。

您对使用贴壁细胞系有什么具体建议吗?悬浮细胞系怎么样?

对于贴壁细胞系,首先需要将细胞从培养皿中分离。我们建议使用胰蛋白酶分离细胞。或者,您可以使用 Accutase,但是在离心过程中得到的细胞沉淀物不会很好地堆积,因此在洗涤步骤中您往往会丢失细胞。悬浮细胞要容易得多。只需使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数,然后收集所需的细胞数量即可。我们没有观察到贴壁细胞和悬浮细胞的检测性能有显著差异。

是否可以对心脏、大脑或发育中的小鼠组织等组织样本进行 CUT&RUN 测定?

我们尚未在组织样品上测试 CUT&RUN 检测试剂盒,因此我们不知道它的效果如何。要对组织进行 CUT&RUN 分析,必须先将组织分解成单细胞悬液,然后再进行 CUT&RUN 分析。在 Derek H. Janssens 等人的出版物(2018; PMID30577869) 中,作者在执行 CUT&RUN 分析之前,先对速冻、融化并分解在 CUT&RUN 洗涤缓冲液中的脑组织进行 CUT&RUN 测定。将脑组织分解成单个细胞是相当容易和迅速的。对于其他更纤维化的组织,我们建议在分解之前进行适当的固定,并在从细胞中分离出消化的 DNA 后执行 CUT&RUN 和交联逆转步骤。

CUT&RUN 是否适用于植物细胞? 您能否分享您可能拥有的任何见解?

我们尚未使用植物细胞测试过 CUT&RUN 检测试剂盒。然而,Xiao-Yu Zheng 等人(2019;PMID30719569)描述了一种预处理植物组织并准备用于 CUT&RUN 的胞核的方法。我们的试剂盒可用于此胞核制备实验步骤的下游。在这种情况下,在 CUT&RUN 分析过程中可能不需要洋地黄皂苷进行细胞通透性,但是如果植物细胞不是 100% 同质性,它可能有助于进一步透化细胞膜。

我们是否需要针对不同细胞类型优化 MNase 消化条件?

我们针对 CUT&RUN 分析而优化的消化条件可在多种细胞系(贴壁和悬浮液)上很好地发挥作用。另外,当增加或减少添加的 pAG-MNase 的量或消化时间时,我们也没有观察到染色质消化的变化。我们的观察结果与 Peter Skene 等人 (2018;PMID29651053)的出版物类似。

您的 CUT&RUN 分析试剂盒是否适用于分离的胞核?

我们的 CUT&RUN 检测试剂盒经过优化,适用于整个细胞,并且适用于大量细胞系,包括贴壁和悬浮细胞。尽管通常不需要为 CUT&RUN 预分离细胞核,但我们的试剂盒应与预分离的胞核一起工作,因为伴刀豆球蛋白 A 珠与细胞和细胞核表面的糖蛋白结合。只有在洋地黄素不能有效渗透的细胞(如酵母细胞或植物细胞)含有细胞壁时,才需要预先分离细胞核。

CUT&RUN 是否偏向于常染色质或异染色质?

否。在我们的测定中,我们没有观察到对常染色质或异染色质有任何偏见。在 CUT&RUN 中,靶标特异性抗体募集 pAG-MNase,并将消化引导至与该抗体直接相邻的染色质,无论是在常染色质中还是在异染色质中。在这种情况下,即使在较难接近的异染色质中,pAG-MNase 与染色质的有效束缚也允许发生消化。我们的 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652已证明可与针对活性、可接近的常染色体组蛋白修饰(参见 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751)和激活转录因子(参见 NF-kB p65 [D14E12] XP® Rabbit mAb #8242))以及抑制性、难以接近的异色组蛋白修饰(参见 Tri-Methyl-Histone H3 [Lys27] [C36B11] #9733)以及与非活性异染色质相关的多梳阻遏物复合蛋白(参见 EZH2 [D2C9] XP® Rabbit mAb #5246RING1B [D22F2] XP® Rabbit mAb #5694)的抗体一起使用。

可接近的染色质,靶标:H3K4me3

可接近的染色质,靶标:H3K4me3: 使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 对 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 CUT&RUN 分析。DNA 库用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备。结果图显示在染色体 12(上图)内的结合,包括 H3K4me3 的已知靶基因 GAPDH(下图)。

可接近的染色质,NF-k8B p65

可接近的染色质,,靶标:NF-kB p65: 使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 对经 hTNF-α #8902(30 ng/ml,1 小时)和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242 处理的 HeLa 细胞进行 CUT&RUN 分析。€‚DNA 库用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备。结果图显示在染色体 1(上图)内的结合,包括 NF-κB p65 的已知靶基因 LAMC2(下图)。

不可接近的异染色质,靶标:Tri-Methyl-Histone H3

不可接近的异染色质,靶标:三甲基组蛋白 H3: 使用 CUT&RUN 检测试剂盒 # 86652,通过 HeLa 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733 进行 CUT&RUN 分析。DNA 库用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备。结果图显示在 20号染色体(上图)内的结合,包括 TCEA2 基因(下图)。

不可接近的异染色质,靶标:Ezh2

不可接近的异染色质,靶标:Ezh2: 使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652,通过 NCCIT 细胞和 Ezh2 (D2C9) XP® Rabbit mAb #5246 进行 CUT&RUN 分析。‚DNA 库用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备。结果图显示在染色体 7(上图)内的结合,包括 EZH2 靶标基因的已知基因簇 HoxA 基因(下图)。

不可接近的异染色质,靶标:RING1B

不可接近的异染色质,靶标:RING1B: 使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652,通过 NCCIT 细胞和 RING1B (D22F2) XP® Rabbit mAb #5694Bmi1 (D42B3) Rabbit mAb #5856 进行 CUT&RUN 分析。‚DNA 库用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备。RING1B 和 Bmi1 均为 PRC1 组分。这些图显示在 HOXD(上图)和 COMMD3(下图)基因内结合。

我可以使用哪些对照物来显示 CUT&RUN 实验正在运行?

无论是通过下游 qPCR 进行 CUT&RUN 分析还是进行 NG-seq 分析,我们始终建议使用经过 CUT&RUN 验证的阳性对照抗体,例如我们的 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和我们的阴性对照抗体 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control Antibody #66362。这些抗体可以与我们的 SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers #7014SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers #7015 配对,以表明您的 CUT&RUN 分析有效,无论所需的靶标特异性抗体的性能如何。所有这些对照物都包含在我们的 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 中。

CUT&RUN qPCR 对照数据

CUT&RUN qPCR 对照数据: 使用此 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652(左小图)或 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005(右小图),对 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 进行 CUT&RUN 与 ChIP 测定。使用 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品的免疫沉淀 DNA 含量,用染色质投入总量(相当于 1)相对应的信号进行表示。

CUT&RUN NGS 对照数据

CUT&RUN NGS 对照数据: 使用此 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005,对 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 CUT&RUN 和 ChIP 测定。DNA 库用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备。上部小图比较了 H3K4me3 在染色体 12上的富集,而下部小图则比较了 H3K4me3 已知靶标 GAPDH 基因上的富集。input通道为 CUT&RUN 中的input样品。

如果找不到针对靶标蛋白的经过 CUT&RUN 验证的抗体,那么为我的 CUT&RUN 分析选择抗体的最佳方法是什么?

我们建议从 ChIP 或 ChIP-seq 验证的抗体开始; 但是,我们发现并非所有经过 ChIP 验证的抗体都能在 CUT&RUN 分析中起作用。或者,Peter J. Skene 等人(2017;PMID28079019)建议,您可能想要尝试通过免疫荧光测定验证的抗体,因为 CUT&RUN 中的抗体结合发生在完整的胞核环境中,类似于免疫荧光测定中的抗体结合条件。

您推荐哪种类型的刺突 DNA?

一些实验步骤利用 pAG-MNase 中污染大肠杆菌的 DNA 进行样品标准化。但是,这在切换 pAG-MNase 批次时会成为问题,因为每批酶都将具有不同量的污染 DNA。相反,我们建议使用单独的酵母刺突 DNA 样品。我们提供酵母刺突 DNA 样品和我们的 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 以及 CUT&RUN pAG-MNase 和刺突 DNA #40366, 每个批次都经过测试并针对 CUT&RUN 进行了优化。这种酵母刺突 DNA 为您的标准化工作提供了更好的批间一致性。

刺突 DNA 如何使 CUT&RUN 分析标准化?

在消化后和 DNA 纯化之前,将指定量的预片段化酵母基因组 DNA 添加到每个 CUT&RUN 反应中。此刺突组件使您可以标准化样品之间的 DNA 纯化、qPCR、库制备和测序效率的差异。我们的 CUT&RUN 检测试剂盒#86652中包含的实验步骤提供关于 qPCR 和 NG-seq 的刺突 DNA 对照的详细说明。重要的是要注意,qPCR 与 NG-seq 所需要的刺突 DNA 的量明显不同,因此请仔细阅读实验步骤。

CUT&RUN DNA 的预期大小分布是多少?

当使用抗组蛋白修饰的抗体时,我们通常会看到片段大小小至 150 bp(单核小体大小),并且经常看到 DNA 片段大小的核小体阶梯(即150、300、450、600 bp)。当使用抗转录因子的抗体时,我们会看到一系列的 DNA 片段大小,大多数大于 35 bp。

靶标:H3K4me3

靶标:H3K4me3: 使用 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 CUT&RUN 检测。DNA 库用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备。使用 Agilent Bioanalyzer®分析库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。如图所示,切除的 DNA 在单核小体上高度富集(峰值约为 300 bp)。

靶标:TCF4/TCF7L2

靶标:TCF4/TCF7L2: 使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 进行的 CUT&RUN 检测中使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA。使用一台Bioanalyzer (Agilent Technologies) 分析文库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。

我在文献中已经读到,当对转录因子进行 CUT&RUN 分析时,应使用苯酚-氯仿纯化 DNA,然后进行乙醇沉淀,因为在用 DNA 亲和柱纯化过程中会丢失生成的小 DNA 片段。这是否正确?

我们建议使用我们的 DNA 纯化缓冲液和旋转柱(用于 ChIP 和 CUT&RUN)#14209 来纯化您的 CUT&RUN DNA。这些旋转柱为纯化 CUT&RUN DNA 提供了一种简单而经济的方法。在并行比较中,我们的 DNA 旋转柱可有效回收大于或等于 35 bp 的 DNA 片段。虽然先用苯酚-氯仿抽提再用乙醇沉淀确实能更有效地回收较小的 DNA 片段,但在分析由两个样品制成的 DNA 库时,我们发现 DNA 色谱柱捕获了约 98% 的全部 CUT&RUN DNA 片段。在苯酚-氯仿和乙醇沉淀样品中发现的DNA片段中约 2% 的长度小于 35 bp。因此,我们的 DNA 旋转柱为纯化 CUT&RUN DNA 片段提供了一种简单、经济且耐用的方法。请注意,并非所有的 DNA 旋转柱都能捕获相同范围的 DNA 片段大小,因此,如果您使用其他供应商的 DNA 旋转柱,则需要确定这些柱保留的最小 DNA 片段大小,因为更大的片段大小临界值会对您的结果产生负面影响。

用于 DNA 纯化的苯酚/氯仿萃取与旋转柱

用于 DNA 纯化的苯酚/氯仿萃取与旋转柱: 比较使用离心柱或苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行的 DNA 纯化。(A) 低量程 DNA 分子量标准(泳道 1,未纯化)使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209(泳道 2)进行纯化,或使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法(泳道 3)进行纯化,并在 4% 琼脂糖凝胶电泳来进行分离。如图所示,苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀能有效回收所有大小的 DNA 片段,而 DNA 离心柱仅能回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 在使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 的 CUT&RUN 检测中使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA。使用一台Bioanalyzer (Agilent Technologies) 分析文库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。因此,文库制备后,起始 35 bp 的 DNA 片段长度将变为 175 bp(图中用蓝色垂直线标注)。如图所示,总 CUT&RUN 富集 DNA 片段中不到 2% 短于 175 bp(起始长度 35 bp),提示 DNA 纯化离心柱足以捕获 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。

是否可以通过 qPCR 分析 CUT&RUN 富集的 DNA,还是必须进行 NGseq 来分析我的数据?

我们的 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 与下游 qPCR 分析兼容。该试剂盒的实验步骤提供了生成输入 DNA 样本的说明和试剂,可用于通过 qPCR 定量您的 CUT&RUN DNA。对于 CUT&RUN DNA 的 qPCR 分析,我们建议设计引物,以产生长度为 60 至 80 bp 的扩增子。

在花钱购买 NG-seq 之前,如何对 CUT&RUN DNA 进行质量控制?

您可以在 NG-seq 之前对 CUT&RUN 分析进行质量控制,方法是对您的富集 DNA 进行 qPCR 分析。我们的 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 与下游 qPCR 分析兼容。

什么是最适合我的 CUT&RUN-qPCR 实验的对照 DNA 样品?

使用下游 qPCR 分析进行 CUT&RUN 分析时,可以使用富含正常 IgG 抗体的样品作为阴性对照,并计算目标特异性抗体的富集度为 IgG 背景的倍数。但是,IgG 样品通常包含极少量的 DNA,并且不能很好地指示您的靶标特异性抗体在测定中的作用。因此,我们建议生成和使用输入染色质 DNA 样品,并按照 CUT&RUN 分析试剂盒 # 86652 的实验步骤中所述进行操作。这样,您可以将目标特异性抗体 DNA 富集表达为总输入 DNA 的百分比,并直接确定靶标特异性抗体在测定中的作用情况。

NG-seq 分析需要多少 CUT&RUN DNA?

这取决于 DNA 库制备试剂盒的敏感性。每个反应的 CUT&RUN DNA 的典型产量为 0.6 至 6 ng。我们的 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 可用于低至 0.5 ng 的起始 DNA。如果起始量太低,您也可以将 PCR 循环数增加到 20,以增加库的扩增。

您建议使用哪种 DNA 库制备试剂盒来进行 CUT&RUN 分析?

我们建议使用我们的 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®56795 # 以及 CUT&RUN 或 ChIP DNA 来制造 DNA 库。该试剂盒应该和我们的 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538SimplechIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 配对。

您是否建议在库制备过程中选择 DNA 的大小?

不,我们不建议在准备用于 CUT&RUN 或 ChIP-seq 的库时执行大小选择。根据我们的经验和客户的反馈,选择大小会大大降低 DNA 库的产量和多样性。如果您担心大于 1kb 的大 DNA 片段,那么在库制备过程中扩增与衔接子连接的 DNA 样品时,只需减少延伸时间。我们发现将延伸时间减少到 10 至 15 秒大大减少了大于 1kb 的大片段的扩增,同时足以在 CUT&RUN 库制备过程中扩增较小和更理想的 DNA 片段。

什么是最适合我的 CUT&RUN NG-seq 实验的对照 DNA 样品?

在进行下游 NG-seq 分析的 CUT&RUN 检测时,可以使用富含 IgG 抗体的正常样品作为阴性对照。但是,我们从其他科学家那里听说过,正常的 IgG 抗体会产生非常低的多样性 DNA 库,并且在 CUT&RUN 检测中可能会产生看起来特别是基因组区域富集的现象,从而使 NG-seq 数据分析变得复杂。相反,我们建议按照 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 的实验步骤中所述生成并使用输入的染色质 DNA 样品。此输入的 DNA 样本生成了一个更多样化的 DNA 库,并且可以更好地用作 NG-seq 分析的阴性对照。

您如何确定 3 到 5 百万个测序读数的 NG-seq 测序深度足以进行 CUT&RUN 分析?

这一决定基于我们对数百份 CUT&RUN 样品的分析。我们发现低于 300 万的测序深度产生的峰太少,并且随着深度测序的增加,峰数增加。如果需要,可以将测序深度增加到每个样品 1000 万个读数。如果每份样品的测序深度大于 1500 万,则测序读数的重复率显著增加。

测序深度比较,目标 H3K27me3

测序深度比较,目标 H3K27me3: 使用 CUT&RUN 检测试剂盒 # 86652,通过 HeLa 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733 进行 CUT&RUN 分析。使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备 DNA 文库。如所示,将相同的 DNA 库以不同的测序深度送入 NGS。该图显示了染色体 11(顶部轨道),MYOD1 基因(中间轨道)和 MYT1 基因(底部轨道)内的结合。

如有任何其他问题,请通过[受保护的电子邮件]直接联系我们的表观遗传学应用组

Christopher Fry - 博士
表观遗传学产品开发总监

Fang Chen, PhD
表观遗传学应用小组组长


发布​于 2021 年 1 月 

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