确保纳入适当的阳性对照和阴性对照。 要了解 Cell Signaling Technology (CST) 测试自身抗体时所用对照的更多信息，请参阅抗体网页或按靶标划分的对照处理表。我们还发现 BioGPS 和 The Human Protein Atlas 是出色的在线资源，可了解不同细胞类型和组织中给定基因产物的相对丰度。
检测翻译后修饰的蛋白质可能需要特殊处理。 CST® 产品网页通常提供在一个或多个细胞模型中激活特定翻译后修饰的处理示例。此外，按靶标划分的对照处理表列出了大多数修饰特异性抗体的已验证阳性对照以及可从 CST 购买的任何对照提取物。PhosphoSitePlus® 也是一个出色的在线资源，可快速概览给定靶标上的已修饰残基、其功能性意义和针对调节特定细胞模型中给定翻译后修饰的处理的已发表参考文献。
为最佳解析您的蛋白质选择合适的凝胶。 CST 使用在 Tris-甘氨酸凝胶上解析的样品验证本公司的大多数蛋白质免疫印迹用抗体。因为这些凝胶允许解析宽大分子量范围内的靶标，我们最常使用 4-20% Tris-甘氨酸梯度凝胶。然而，单一百分浓度的凝胶更易在实验室中制备，并且可以在更有限的分子量范围提供优越的分辨率。一般规则是分子量越小，需用凝胶的百分浓度越高，反之亦然。我们根据靶标蛋白的分子量推荐以下凝胶。
| 凝胶类型 | 蛋白质分子量 |
|---|---|
| 3-8% Tris-醋酸盐* | > 200 kDa |
| 4-20% Tris-甘氨酸 | 10-200 kDa |
| 7.5% Tris-甘氨酸 | 80-200 kDa |
| 10% Tris-甘氨酸 | 50-80 kDa |
| 12% Tris-甘氨酸 | 30-60 kDa |
| 16% Tris-甘氨酸、12% Tris-甘氨酸 | < 30 kDa |
*与 Tris-醋酸盐 SDS 缓冲液一起使用的 Tris-醋酸盐凝胶在中性 pH 电泳。因此，Tris-醋酸盐凝胶可以长时间电泳，甚至过夜电泳，而蛋白质并不从凝胶迁移出来。由于更大的蛋白质需要更长的电泳时间来实现分离，因此对于分子量高的蛋白质，Tris-醋酸盐凝胶充当比 Tris-甘氨酸凝胶更好的选项。
选择与一抗兼容的二抗。 所有非偶联的 CST 抗体均使用本公司的抗 IgG，HRP 抗体在内部针对蛋白质免疫印迹法验证过。兔只具有一个 IgG 亚型，因此 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074) 适于配合所有兔多克隆和单克隆抗体使用。推荐 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076) 配合小鼠单克隆抗体使用，因为它识别所有小鼠 IgG 亚型。类似地，推荐 anti-rat IgG, HRP-linked Antibody (#7077) 配合大鼠单克隆抗体使用，因为它识别所有大鼠 IgG 亚型。
遵循推荐的实验步骤。 CST 抗体是使用产品网页上所列实验步骤中概述的条件开发和优化的。首次使用抗体时，请使用推荐的缓冲液和稀释液以获得最佳结果。偏离推荐的实验步骤可能产生低信号或高背景，从而导致需要重复实验。
为了获得最佳的荧光蛋白质印迹条件，我们推荐严密遵循 CST 荧光蛋白质印迹实验步骤。对化学发光实验步骤的一些显著改变包括：