SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂针对手动实验步骤和 Leica Biosystems 的 BOND RX 全自动研究染色机实验步骤进行了优化和验证。但如果您需要解答在检测中遇到的问题，请参阅下面的列表以了解潜在的问题、可能的原因和建议。
| 描述 | 可能的原因 | 建议 |
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| 所有信道都看不到荧光信号，我的切片是空白的。 | 有可能在染色过程中遗漏了试剂盒的关键成分。 | 在进行检测之前，确认添加了所有试剂。 |
| 该组织可能不表达目的靶标。 | 有必要使用对照切片以排除任何潜在的试剂问题。 |
| 描述 | 可能的原因 | 建议 |
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| 所有信道都能看到信号，但信号比预期弱得多。 | SignalStar 试剂和溶液粘稠。SignalStar 溶液（尤其是放大液 1 和 放大液 2）的混合可能不充分。 | 使用低吸附移液器吸头合并 SignalStar 试剂盒所有组分，并在室温上下颠倒转动 20 分钟。 |
| 在应用放大液 2 之前的洗涤步骤后，可能残留有残余的放大液 1。 | 确保每个切片完全浸入 dH2O 中，并在应用放大液之前通过轻弹从组织表面去除多余的液体。 | |
| BOND RX 自动染色机上的溶液清洗不充分。 | 如实验步骤中所述，确保在 BOND RX 软件中将所有洗涤步骤选择为“打开”。 | |
| 如果切片未在染色后 8 小时内成像，则荧光信号可能减弱。 | 确保染色后尽快在最长 8 小时内对切片进行成像。 | |
| 在手动实验步骤期间执行的扩增可能少于 8 个完整轮次。 | 在这些步骤期间，使用手动实验步骤中提供的清单。 | |
| 在 BOND RX 实验步骤期间执行的扩增可能少于 6 个完整轮次。 | 在这些步骤期间，使用手动实验步骤中提供的清单。 | |
| 虽然所有抗体都经过彻底验证可用于许多组织，但组织质量和表达水平各不相同。 | 增加抗体量（2 倍）将增加信号强度。 |
| 描述 | 可能的原因 | 建议 |
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| 我在其中一个荧光信道中没有看到任何信号，但序列切片上的显色染色表明该靶标有很强的信号。 | 没有为该荧光信道添加互补性寡核苷酸。 | 在进行检测之前，确认添加了所有试剂。 |
| 没有为该荧光通道添加扩增寡核苷酸 A 或 B。 | 在进行检测之前，确认添加了所有试剂。 | |
| 可能是使用了不正确的激光和滤光片套装对切片进行成像。 | 该实验步骤包含有关此检测中使用的所有荧光团的激光、滤光片套装、激发和发射的信息。确认您的仪器设置相符。 |
| 描述 | 可能的原因 | 建议 |
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| 我的检测板的某些信道中存在背景荧光。 | 虽然所有抗体都经过彻底验证可用于许多组织，但组织质量和表达水平各不相同。 | 减少抗体量（0.5 倍）可能有助于降低背景水平，同时保持靶标信号强度。 |
| 所有抗体均已在实验步骤中描述的抗原修复方法的背景下进行了验证。如果使用替代方法，可能会导致更高的背景水平。 | 确保您使用实验步骤中所述的抗原修复方法。 | |
| 使用手动实验步骤，可以在信道中执行更少的扩增循环以减少噪音。 | 例如，要在信道 488、594 和 750 中执行 8 次扩增循环，但仅在 647 中执行 6 次：为所有信道的 6 轮扩增制作放大液。然后，制备由 488、594 和 750 的扩增寡核苷酸组成的单独放大液，用于最后的 2 轮扩增。 |
| 描述 | 可能的原因 | 建议 |
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| 来自靶标的类似信号存在于多个荧光信道中；例如，647 信道中的染色看起来与 594 信道中的靶标相似。 | 这可能是由于 594 信道中缺乏靶标表达，使得该信道中几乎没有/没有信号。同时，647 信道中可能存在强表达，使得光谱渗漏导致了 594 信道中的信号。由于这种现象，594 信道中的弱特定信号可能会被淹没。 | 减少 647 信道中的抗体量可能有助于解决此信号渗漏问题。 在检测板设计期间可以考虑光谱渗漏，从而将强表型标记物与弱表达靶标进行光谱分离。 |
| 描述 | 可能的原因 | 建议 |
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| 我在单个信道中看到来自多个靶标的荧光信号。 | 第 1 轮成像和第 2 轮成像的互补性寡核苷酸可能被错误合并，从而扩增了同一信道内的 2 个靶标。 | 请确保您不会合并同一轮成像中相同荧光信道的互补性性寡核苷酸。对于每个荧光信道，成像轮次可以含有仅 1 种互补性性寡核苷酸。 |
| 描述 | 可能的原因 | 建议 |
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| BOND 滴定插入物已脱离其载体，从而导致 BOND RX 自动染色机发生故障且无法完成染色运行。 | 在对第 1 轮成像和第 2 轮成像执行 SignalStar 检测后，未运行抽吸探针清洁循环。 | 每次运行 SignalStar 切片后，始终运行抽吸探针清洁循环。 如需其他信息和帮助，请联系您的仪器提供商。 |
| 我在 BOND RX 软件上收到一条“空”容器错误消息。 | 如果容器装得太满，BOND RX 自动染色机将认为容器是“空的”。 | 确保打开的容器没有过量填充 SignalStar 试剂。如实验步骤中所示，某些试剂可能需要多个容器。 如需其他信息和帮助，请联系您的仪器提供商。 |
| 我在 BOND RX 软件上收到一条错误消息，显示“试剂不足”。 | 尽管使用了 SignalStar Multiplex IHC 实验步骤中指示的正确量的溶液，但 BOND RX 自动染色机可能仍会认为试剂“不足”。 | 再次尝试装溶液，并扫描容器。您可能需要使用新的容器来消除此错误。 如需其他信息和帮助，请联系您的仪器提供商。 |