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使用 SignalStar™ Multiplex IHC 进行空间分析

 

CST 的 SignalStar Multiplex IHC 检测试剂盒为您的空间生物学研究提供了可定制、灵活且经过高度验证的抗体组合。

以高灵敏度和特异性在 FFPE 组织中同时扩增多种生物标记物，并在短短 2 天内生成多达 8 个生物标记物的结果。

什么是 SignalStar Multiplex IHC？

SignalStar Multiplex IHC 技术采用抗体、寡核苷酸和荧光团来探究细胞存在情况、位置、功能和生物标记物共表达模式。SignalStar 测定法能够检测多个表型和功能标记物，同时维持空间背景和组织结构。在空间生物学中，这些洞见对了解细胞如何组织并相互作用以影响组织微环境及推动疾病进展和对治疗作出反应至关重要。

Multiplex IHC 如何实现空间分析

Multiplex IHC (mIHC) 是一种多功能且强大的空间生物学工具，可用于回答各种研究问题。无论您是需要了解生物标记物和细胞的原生状态、最大限度地获取数据、了解细胞功能，还是仅仅因为 RNA 信息不够而要检测蛋白质，mIHC 都是理想的解决方案。

了解原生状态下的生物学和功能

Multiplex IHC 能够在单个组织样品中同时检测多种表型和功能性蛋白质生物标记物，包括磷酸化等蛋白质修饰，保持生物标记物的原始空间和细胞背景，并深入了解细胞和组织的潜在功能。

最大限度地获取数据

Multiplex IHC 可让您最大限度地增加从 FFPE 样品中获取的数据量，从而减少对额外组织样品的需求。

更深入的蛋白翻译后修饰洞察力

虽然 RNA 分析可以提供有关基因表达的信息，但它无法捕获翻译后蛋白质修饰，例如磷酸化、糖基化和乙酰化。Multiplex IHC 可以同时检测多种蛋白质修饰，从而更全面地了解基础生物学。

它是如何工作的

用于 FFPE 组织分析的 SignalStar Multiplex IHC 检测分步工作流程。

SignalStar mIHC 检测可同时标记 FFPE 组织中多达 8 种生物标记物。脱蜡且再水化的 FFPE 组织切片首先经过抗原修复 (A)，然后在一步一抗孵育步骤中混合添加针对您所选靶标数目（最多 3-8 种寡核苷酸偶联抗体）的所有抗体 (B)。带荧光染料（通道：488、594、647 和 750）的互补性寡核苷酸网络通过构造与抗体接合的寡核苷酸-荧光团结构体，在第一轮成像中放大多达 4 种寡核苷酸偶联抗体的信号(C-D)。如果检测靶标的数量大于 4，则需要柔和移除第一轮成像的寡核苷酸和荧光基团 (E)，接着进行第二轮放大以可视化多达 4 种额外的寡核苷酸偶联抗体 (F)。然后将二张图片用软件进行对齐与重合，以生成 8 标染色图像 (G)。

组织制备

  • 组织的收集和固定至关重要，因为这直接影响样品的完整性和实验结果。影响组织的收集、保存和固定方法根据样品或关注标记物而变化。
  • 福尔马林等交联固定剂常用于制备多重 IHC 样品，因为它们会保留组织的结构完整性，有助于维持组织架构。

抗原修复

  • 用于保持组织样品结构完整性的固定剂可能会隐藏您的抗体旨在识别的表位。
  • 有几种方法可用来显示在固定过程中被隐藏的表位，包括蛋白水解诱导的抗原修复或热诱导的表位修复 (HIER)。

抗体孵育

  • 从不断增加的抗体菜单中选择经过验证的抗体，这些抗体可以与我们通用的手动和自动实验步骤任意组合在一起。这些经过充分验证的实验步骤使您能够轻松地重新设计检测板，并让其即刻可用。
  • 所有抗体均同时添加，从而消除了抗体循环以及多轮成像期间表位降解或遮蔽的任何可能性。
  • 使用 10% 中性缓冲福尔马林进行短暂的染色后固定可确保抗体在扩增和成像过程中保留在切片上。

寡核苷酸扩增

  • 寡核苷酸可以放大荧光信号，从而能够检测广泛的动态生物标记物范围，并使组织自发荧光更加明亮。
  • 为前 4 个寡核苷酸偶联抗体添加每个抗体特异性的互补寡核苷酸，然后加入带有荧光团的其他寡核苷酸以指数级放大信号。
  • 荧光团在光谱上是不同的，可减少光谱分解的需要。
  • 轻轻去除含有荧光团的寡核苷酸，使抗体保持完整，从而能够进行第二轮扩增和成像。
  • 将任意抗体与几乎任意荧光团配对以进行您的特定实验。

您能用 SignalStar Multiplex IHC 做什么

只需 2 天即可获得结果

使用其他用于空间分析的多重技术的Panel优化和验证可能需要耗时数周到数月。SignalStar 技术凭借优化的即用型检测板而无需这么长时间。从开箱即用的在 FFPE 组织中经过 IHC 验证的抗体清单中选择生物标记物。

SignalStar 测定法可在单个组织中放大多达 8 种蛋白质的荧光信号。使用这些第一时间给予您所需信号的高灵敏测定法，自信分析有限、珍贵的 FFPE 组织样品。

对石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌组织进行 SignalStar mIHC 分析。

使用 Pan-Keratin (C11) & CO-0003-488 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #63566（青色）、CD68 (D4B9C) & CO-0007-594 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #77318（橙色）、SIRPα/SHPS1 (D6I3M) & CO-0034-647 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #80150（粉红色）、CD163 (D6U1J) & CO-0022-750 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #71043（洋红色）、CD206/MRC1 (E2L9N) & CO-0035-488 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #99626（绿色）、CD11c (D3V1E) & CO-0017-594 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #85384（黄色）、CD45 (Intracellular Domain) (D9M8I) & CO-0013-647 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #32740（红色）和 HLA-DRA (E9R2Q) & CO-0023-750 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #58446（白色），对石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌组织进行 SignalStar 免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩，如图所示。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 自动染色机上进行多重染色。

轻松地重新设计检测板

许多用于空间生物学的解决方案对于不断变化的研究需求来说缺乏灵活性。SignalStar 检测板可根据您的实验需求变化而灵活更改生物标记物并重新设计检测板。无论您在 SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 中设计的检测板如何，SignalStar 技术都能持续染色，并且检测板开箱即可使用。

实验步骤经过验证和优化，证明了跨越不同抗体组合、实验和成像仪器的可重复性。

组织芯片中石蜡包埋的人甲状腺髓样癌组织序列切片的 SignalStar mIHC 分析。

对组织芯片中石蜡包埋的人甲状腺髓样癌组织进行 SignalStar 多重免疫组织化学分析。 Panel 1： PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-647 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #52085（黄色）、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-594 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #35347（未显示）、CD68 (D4B9C) & CO-0007-488 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #73071（未显示）和 CD3ε (D7A6E) & CO-0001-750 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #51754（未显示）。Panel 2：PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-647 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #52085（黄色）、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-594 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #35347（未显示）、CD68 (D4B9C) & CO-0007-488 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #73071（未显示）和 CD8 (D8A8Y) & CO-0004-750 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #62750（未显示）。Panel 3：PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-647 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #52085（黄色）、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-594 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #35347（未显示）、Ki-67 (8D5) & CO-0014-488 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #89034（未显示）以及 CD8ɑ (D8A8Y) & CO-0004-750 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #62750（未显示）。如图所示，所有荧光团都被指定为伪彩。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 自动染色机上进行多重染色。与使用 PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-647 SignalStar Oligo Antibody Pair #52085（黄色）的单重 SignalStar 染色以及使用 PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684 的显色染色相比较，在三个独特的 SignalStar 4 重检测板的连续切片中，在目标匹配区域中定量 PD-L1 阳性细胞的百分比。

放大信号

不同于许多其他解决方案，SignalStar mIHC Panel 具有信号放大作用，让您能够看到比以前更多的生物标记物，并检测到低表达水平的生物标志物。

对石蜡包埋的人扁桃体组织进行 SignalStar 多重免疫组织化学分析。

与 PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) XP® Rabbit mAb #86163（使用抗兔 IgG (H+L) 检测到）、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414 和 PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 相比较，使用 PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-647 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #56837（红色）和 ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961（蓝色）对石蜡包埋的人扁桃体组织进行 SignalStar 多重免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩，如图所示。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 自动染色机上进行多重染色。与间接和直接荧光方法相比，在 SignalStar 测定法的序列组织切片的匹配目的区域中定量 PD-1 阳性细胞的平均荧光强度。

实验结果每次均可重现

CST 在 SignalStar 检测中验证抗体并保证它们能按预期发挥作用。每种 SignalStar 抗体均根据显色黄金标准进行验证，并且在重复实验中始终具有良好的可重现性。

我们的验证过程从 IHC-P 验证开始，然后是 SignalStar Multiplex IHC 的抗体验证。

对石蜡包埋的人结直肠腺癌组织进行 SignalStar 多重免疫组织化学分析。

使用 Pan-Keratin (C11) & CO-0003-488 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #63566（绿色）、PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-594 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #28249（黄色）、CD20 (E7B7T) & CO-0011-647 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #36775（红色）和 CD8ɑ (D8A8Y) & CO-0004-750 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair #62750（青色）对石蜡包埋的人结直肠腺癌组织进行 SignalStar 多重免疫组织化学分析。包含具有代表性的单个和 4 重图像。如图所示，所有荧光团都被指定为伪彩。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 自动染色机上进行多重染色。与显色性相比，在 SignalStar 检测 (n=2) 的序列切片的目标匹配区域中定量阳性细胞的百分比。

使用您现有的荧光成像仪器

有着明确发射峰的稳定荧光信号使 SignalStar mIHC Panel 可以与您的现有成像仪器兼容。

使用与通道 488、594、647 和 750 nm 兼容的显微镜对切片进行成像，以处理 3-8 重检测。在 6 小时的实验步骤运行时间内，可以在 1 天内对 4 重检测进行染色和成像，或在 2 天内对 8 重进行染色和成像。自动化实验步骤可实现过夜染色，大大减少了手动操作时间。

设计您自己的 Multiplex IHC Panel 时的注意事项

消除抗体循环

一次性添加所有抗体，无需担心表位丢失或遮蔽。

加快实验设计速度

我们的 SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 使用方便，可为您完成设计工作，从而帮您节省时间。

结果值得信赖

SignalStar 检测板中使用的每种抗体都经过独立验证，可用于其预期应用，并保证像所有 CST® 抗体一样发挥预期作用，从而在第一次以及每次检测时为您提供可靠、可重现的结果。您还可以利用市场上引用最多的抗体。*

*在同行评议出版物里最常引用的 10 种抗体当中，6 种来自 CST，在前 100 种引用的抗体中超三分之一的抗体来自 CST，包括引用最多的一抗和二抗。来源：CiteAb Blog, “What were the top 100 research antibodies of 2022?” July, 2023.

Cell Signaling Technology、CST 和 SignalStar 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。Cy 是 GE Healthcare 的注册商标。所有其他商标均属各自所有者专有。访问 cellsignal.com/trademarks 以了解更多信息。

第 10,781,477 号美国专利，外国对应物，以及由此而来的儿童专利。

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