CUT&RUN 概述

了解 CUT&RUN —— ChIP-qPCR 和 ChIP-seq 的一种低细胞量替代方案，可用来分析染色质中的蛋白质-DNA 相互作用。

什么是 CUT&RUN？

染色质免疫沉淀 (ChIP) 和 ChIP-seq 等能够分析蛋白质-DNA 相互作用的方法的出现，使人们逐渐认识到，异常的表观遗传调节可以导致多种人类疾病。核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 是一项可用于染色质分析的新技术。

它是如何工作的

CUT&RUN 是一种使用靶标特异性一抗和 Protein A-Protein G-Micrococcal Nuclease (pAG-MNase) 来分离特异性蛋白质-DNA 复合物的体内方法^1,2,3。从细胞到 DNA 只需 1 至 2 天，并且它可以自动化，以实现最大的通量和可重复性⁴。

CUT&RUN 工作流程，包括果蝇 Spike-in 标准化策略

为了分离目标蛋白质-DNA 复合体，首先收集细胞，然后让其结合 Concanavalin A 包被的磁珠上，以方便细胞处理，并在后续清洗过程中最大程度减少细胞丢失。细胞膜用洋地黄皂苷透化，便于一抗进入胞核；在胞核内，一抗会结合靶标组蛋白、转录因子或辅因子。pAG-MNase 融合蛋白的 pAG 结构域随后结合一抗重链，从而使酶靶向至目标染色质区域。添加 Ca²⁺ 可激活 pAG-MNase，以启动 DNA 消化。这会使被切割的染色质复合体从基因组染色质中扩散出来、脱离胞核并进入样品上清液，使用 DNA 离心柱或苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀的方法便可从上清液中收集这些被切割的染色质复合物。

纯化、富集的 DNA 随后使用 qPCR 检测和定量，或用二代测序分析 (NGS) 与全基因组比对构建 DNA 测序文库。

CUT&RUN 标准化

为了使 CUT&RUN 检测更具定量性并且标准化不同反应之间的信号，可选择以下两种 spike-in 策略之一（同时使用两者则会造成冗余）。

• 对于下游标准化：在 MNase 消化步骤后添加酵母 DNA spike-in。<br/>
• 对于全工作流程标准化（如上所示）：在实验开始时添加果蝇 spike-in 细胞核；随后在一抗孵育步骤中添加相应的 H2Av 抗体。

请注意，这两种 spike-in 方法均设计用于在靶向同一蛋白的不同样品之间进行信号比较（例如，比较多个样品间的 H3K27me3 水平）。它们不能被用于不同靶标之间的定量比较，例如比较 Ezh2 样品与 H3K27me3 样品的信号。阅读相关博客，了解更多有关这些 spike-in 策略的信息。

为您的实验选择合适的 CUT&RUN 标准化对照

CST 提供了两种 CUT&RUN 试剂盒，以满足您的特定标准化要求。

果蝇 Spike-in 标准化可提高药物响应数据的可信度<br/>

以下实验展示了果蝇 spike-in 标准化策略如何提高数据的可信度，确保所观察到的全局组蛋白标记变化代表真实的生物学响应，而不是技术变异。在标准化数据中，接受他泽司他处理的样品显示 H3K27me3 信号降低，与 EZH2 抑制一致，而 H3K4me3 信号仍保持不变。

使用 100,000 个用或未用 1 μM 他泽司他处理 6 天的 MCF7 细胞（按指示）以及 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit Monoclonal Antibody #9733 或 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了 HOXD 基因簇和 ACTB 基因上的结合情况，二者分别是 H3K27me3 和 H3K4me3 的已知靶标。使用果蝇 spike-in 策略进行标准化后，EZH2 抑制剂处理后的 H3K27me3 信号显著降低，与 H3K27me3 水平降低一致。相比之下，H3K4me3 信号仍然保持稳定，因为该药物不影响 H3K4me3。

使用果蝇 Spike-In 对照实现各细胞滴定间的准确信号标准化<br/>

果蝇 spike-in 标准化可确保 CUT&RUN 信号强度随起始细胞数量按比例变化。在下面的细胞滴定实验中，这可以准确比较 HOXA 基因座上 H3K27me3 的富集程度，并提高了可信度，确保观察到的差异反映了真实的起始量依赖性变化，而非技术变异性。

使用 200,000、100,000、50,000 或 20,000 个 MCF7 细胞（按指示）和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit Monoclonal Antibody #9733 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了在 HOXA 基因簇（H3K27me3 的已知靶标）上的结合情况。使用果蝇 spike-in 策略进行标准化后，信号强度与起始细胞数量呈正相关。

使用片段化酵母 DNA 标准化的 qPCR 数据

使用酵母 spike-in DNA 对您的样品进行标准化，可实现同一实验内或考察同一蛋白质的不同实验间样品的实验可重复性。

使用因 qPCR 分析而加入的 DNA 对 CUT&RUN 检测信号进行标准化。使用 CUT&RUN Assay Kit #86652、递减数量的 HCT 116 细胞与 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751（顶部小图）或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit Monoclonal Antibody #13499（底部小图）进行 CUT&RUN 测定。使用 SimpleChIP^® Universal qPCR Master Mix #88989 以及 SimpleChIP^® Human GAPDH Exon 1 Primers、SimpleChIP^® Human beta-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP^® Human beta-Actin 3' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP^® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中的免疫沉淀 DNA 数量表示为与输入染色质总量（100,000 个细胞的输入百分比）相对应的信号。左图中为非标准化的富集结果。在每次反应中，按照与起始细胞数量成比例的方式添加酵母标准化 Spike-in DNA。根据每份样品中添加 DNA 所产生的 qPCR 信号差异，将 CUT&RUN 信号标准化为含 100,000 个细胞的样品。右图显示了标准化后的富集。

CUT&RUN 的优点

两种 CST CUT&RUN 试剂盒均具有以下优点：

使用改进的实验步骤获得更好的数据<br/>

对 CST^® CUT&RUN 实验步骤的进一步开发带来了可提高数据质量的优化，并验证了两款 CUT&RUN 检测试剂盒在更广泛样品类型中的适用性。例如，我们建议在 4°C 而不是 0°C 下进行消化，以促进目标染色质片段的回收，而不会显著增加背景。这改进了 qPCR 和 NG-seq 分析，特别是对于转录因子和辅因子。

使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 NCCIT 细胞和 SUZ12 (D39F6) Rabbit Monoclonal Antibody #3737 进行 CUT&RUN 测定。按照指示在 0°C 或 4°C 下消化 DNA。在小图 A，使用 SimpleChIP^® Human HoxA1 Intron 1 Primers #7707、SimpleChIP^® Human HoxA2 Promoter Primers #5517 和 SimpleChIP^® Human alpha Satellite Repeat Primers #4486，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。在小图 B，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示在 HoxA 基因内结合。

通过使用少 5-20 倍的样品来节省时间

如果条件允许，建议每次 CUT&RUN 检测使用 100,000 个细胞。然而，CST 意识到这并不总是可行，因此已验证这两款 CUT&RUN 试剂盒，二者均可使用低至 5,000-20,000 个细胞，具体用量取决于靶标类型。

组蛋白（靶标通用性）

在研究组蛋白时，在 CUT&RUN Assay Kit #86652 上使用 100,000、10,000 或 5,000 个细胞时观察到类似的结合模式。

使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 在细胞数目渐减下进行 CUT&RUN 测定。在小图 A，使用 100,000、10,000 或 5,000 个 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。各图显示在染色体 12 上的结合情况（上图），包括 H3K4me3 的已知靶标基因 GAPDH（下图）。在小图 B 中，使用 100,000、10,000 或 5,000 个 Hela 细胞（按指示）和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit Monoclonal Antibody #9733 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。结果图显示在染色体 20 上的结合情况（上图），包括 H3K27me3 的已知靶标基因 MYT1（下图）。

转录因子（靶标通用性）

当研究转录因子时，在 CUT&RUN Assay Kit #86652 上使用 100,000、20,000 或 10,000 个细胞观察到相似的结合模式。

使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 在细胞数目渐减下进行 CUT&RUN 测定。在小图 A，使用饥饿过夜且经过 human β-nerve growth factor (hβ-NGF) (50 ng/mL) 处理 2 小时的 100,000、20,000 或 10,000 个 PC-12 细胞和 Phospho-c-Jun (Ser73) (D47G9) Rabbit Monoclonal Antibody #3270 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。结果图显示了在染色体 2 上的结合情况（上图），包括磷酸化 c-Jun 靶标基因 Dclk1（下图）。在小图 B 中，使用 100,000、20,000 或 10,000 个 HCT 116 细胞和 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit Monoclonal Antibody #2569 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。结果图显示在染色体 8 上的结合情况（上图），包括 TCF4 的已知靶标基因 MYC（下图）。

辅因子（靶标通用性）

当研究辅因子时，在 CUT&RUN Assay Kit #86652 上使用 100,000、20,000 或 10,000 个细胞观察到相似的结合模式。

使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 100,000、20,000 或 10,000 个 NCCIT 细胞和 SUZ12 (D39F6) Rabbit Monoclonal Antibody #3737 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了跨 HoxD（上图）和 HoxA（下图）（SUZ12 的已知靶基因）的结合。

自信地研究组织样本中的蛋白质-DNA 相互作用

当涉及在有限的样本类型（如组织）中分析染色质时，执行 ChIP 实验所需的高样本输入是极其严格的。CUT&RUN 为培养细胞提供的样品节省扩展到组织样品。根据组织类型的不同，ChIP 实验可能需要 25 至 50 mg 的组织，而 CST CUT&RUN 试剂盒仅需约 1 至 2.5 mg 组织（具体用量依组织类型而定）。

在使用 CST CUT&RUN 试剂盒探索蛋白质-DNA 相互作用时，即使使用仅约二十分之一的样品，经过验证的实验步骤也能让您对数据充满信心。

心脏组织 - 组蛋白和转录因子<br/>

使用我们的 CUT&RUN 试剂盒分析 H3K4me3 和转录因子 MITF 的蛋白质-DNA 相互作用只需要 1 mg 心脏组织。

使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 1 mg 轻度固定的小鼠心脏组织（0.1% 甲醛，2 分钟）和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 或 MITF (D3B4T) Rabbit Monoclonal Antibody #97800 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示在染色体 19（上图）上 H3K4me3 和 MITF 的结合，包括 Ifit2 基因（下图）。

脑组织 - 组蛋白和转录因子<br/>

使用我们的 CUT&RUN 试剂盒分析 H3K4me3 和转录因子 Brn2/POU3F2 的蛋白质-DNA 相互作用只需要 1 mg 脑组织。

使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 1 mg 轻度固定的小鼠脑组织（0.1% 甲醛，2 分钟）和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 或 Brn2/POU3F2 (D2C1L) Rabbit Monoclonal Antibody #12137 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。结果图显示在染色体 6（上图）上 H3K4me3 和 Brn2 的结合，包括 Snrpg 基因（下图）。

肝组织 – 组蛋白和转录因子<br/>

使用我们的 CUT&RUN 试剂盒分析 H3K4me3 和糖皮质激素受体转录因子的蛋白质-DNA 相互作用只需要 1 mg 肝组织。

使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用仅 1 mg 中度固定的小鼠肝组织（0.1% 甲醛，10 分钟）和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 或 Glucocorticoid Receptor (D6H2L) Rabbit Monoclonal Antibody #12041 进行 CUT&RUN 分析。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了染色体 8（上图）上的 H3K4me3 和糖皮质激素受体结合，包括 Mt2 基因（下图）。

肝组织 – 辅因子<br/>

使用我们的 CUT&RUN 试剂盒分析辅因子 SUZ12 和 RING1B 的蛋白质-DNA 相互作用仅需要 2.5 mg 肝组织。

使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对 2.5 mg 中度固定的小鼠肝组织（0.1% 甲醛，10 分钟）和 SUZ12 (D39F6) Rabbit Monoclonal Antibody #3737 或 RING1B (D22F2) Rabbit Monoclonal Antibody #5694 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了 SUZ12 和 RING1B 跨 HoxA（上图）和 HoxD（下图）基因区域的结合。

在原代细胞中分析染色质<br/>

CST CUT&RUN 试剂盒显著降低了细胞数量要求，使研究原代细胞中的蛋白质-DNA 相互作用成为可能。不要仅仅为了满足细胞数量要求而妥协您想要的样品类型。

使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 100,000 个人 CD8+ 活 T 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 或 CTCF (D31H2) Rabbit Monoclonal Antibody #3418 进行 CUT&RUN 测定。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。上图显示在染色体 8 上的结合情况，而下图显示 MYC 基因（H3K4me3 和 CTCF 的已知靶标）周围的富集。请参阅 #3418 说明书中包含 CUT&RUN-qPCR 数据的其他结果图。

节省测序成本<br/>

背景相对较低是指您可在测序深度较低的情况下，区分您的信号与基因组背景噪音。仅需 300 - 500 万次高质量读长便可获得测序数据，显著降低了您的测序成本。有额外收获吗？ 这种方法的低背景还可能用于分析低信号基因组特征。

避免出现“交联假象”<br/>

CUT&RUN 适用于天然染色质，并且无需进行可能会导致“交联假象”的交联或免疫沉淀。

抗体范围广<br/>

pAG-MNase 结合鼠抗和兔抗，从而增加了适用于 CUT&RUN 检测的抗体目录。

兔抗

通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 Hela 细胞和 Acetyl-Histone H3 (Lys27) (D5E4) Rabbit Monoclonal Antibody #8173 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。小图 A 比较了 H3K27Ac 在 12 号染色体上的富集，而小图 B 则比较了 H3K27Ac 在其已知靶标 GAPDH 基因上的富集。

小鼠抗体

通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 Hela 细胞和 Rpb1 CTD (4H8) Mouse Monoclonal Antibody #2629 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。小图 A 比较了 Rpb1 在染色体 12 上的富集，而小图 B 则比较了 Rbp1 在已知靶标 GAPDH 基因上的富集。

产品供应

无论您是一个才刚开始在研究中探索基因调控或染色质重塑的新手，还是深耕表观遗传学领域的专家，CST 都可为您的 CUT&RUN 检测提供灵活的解决方案。您所需要提供的就是针对您的目的蛋白的一抗。CST 根据您的 spike-in 对照偏好，通过两款订购便捷的 CUT&RUN 试剂盒提供其余所有所需材料。每个试剂盒均包含您需要的所有缓冲液和试剂，并附有详细的实验步骤。您也可以单独按需订购所需试剂。所有产品均经过内部验证，确保您获得 CST 一贯的高质量试剂和值得信赖的实验结果。

参考文献

1. Skene PJ, et al. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. (2018) Nat. Protoc 13(5), 1006-1019. Pubmed 29651053
2. Meers MP, et al. Improved CUT&RUN chromatin profiling and analysis tools. (2019) BioRxiv 1, 569129. bioRxiv 569129
3. Skene PJ, and Henikoff S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. (2017) Elife 6, e21865. Pubmed 28079019
4. Janssens DH, et al. Automated in situ chromatin profiling efficiently resolves cell types and gene regulatory programs. (2018) Epigenetics Chromatin 22(1), 74. Pubmed 30577869
5. Egan, B. et al. An Alternative Approach to ChIP-Seq Normalization Enables Detection of Genome-Wide Changes in Histone H3 Lysine 27 Trimethylation upon EZH2 Inhibition. (2016) PLoS ONE 11, e0166438
6. Taruttis, F. et al. External calibration with Drosophila whole-cell spike-ins delivers absolute mRNA fold changes from human RNA-Seq and qPCR data. (2017) Biotechniques 62, 53-61 Pubmed 28193148

_{美国专利第 11,733,248 号、外国等效专利及从中衍生的子专利。}

_{本产品根据 Active Motif 拥有的某些专利进行供应和销售，涉及美国专利号 9938524、10689643、11306307 和 12049622，以及其他国家/地区的相关专利。仅供购买者内部研究使用。不得用于转售、服务或其他商业用途。}

_{第7,429,487号美国专利，外国对应物，以及由此而来的儿童专利。}

_{Cell Signaling Technology 和 SimpleChIP 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。}

_{所有其他商标均为各自所有者专有。访问 cellsignal.com/legal/trademark-information 以了解更多信息。}