免疫平行反应监测 (iPRM)

在白细胞介素-4 (IL-4) 干扰的情况下人肾癌细胞系 ACHN 中磷酸化靶标的免疫-PRM 检测数据和相应的蛋白印迹结果。细胞用 40 ng/ml 人源白细胞介素-4 (hIL-4)#8919 处理 20 分钟后再收集。对于 iPRM 实验，ACHN 细胞蛋白用胰蛋白酶消化，随后将 100 µg ACHN 胰蛋白酶肽与用重同位素标记的肽混合在一起，以作为内部标准品。使用以下每种 CST 抗体 (5 µg) 进行多重免疫沉淀。AKT S473 (#4060), CDK1/2/3 Y15 (#4539), PRAS40 T246 (#2997), STAT3 Y705(#9145), STAT5A/B Y694 (#9314), STAT6 Y641 (#9364), ERK1 T202/Y204(#4370), ERK2 T185(#4370), ERK2 T185 (#4370), Jun S73(#3270). 在免疫富集之后，使用 Q Exactive™ 质谱仪对肽进行多重 PRM 分析。随后从 Skyline 中提取峰面积，并根据肽轻重链比例计算肽浓度。免疫捕获和 PRM 分析重复进行三次。用于 iPRM 实验的抗体也用于蛋白印迹实验。对于每种印迹，往 4%-20% 的 SDS-PAGE 梯度凝胶上上样 20 微克对照和经处理的 ACHN 细胞的蛋白提取物。在转移到硝酸纤维素膜上之后，使用稀释比为 1:1000 的磷酸化特异性抗体检测蛋白。

在白细胞介素-4 (IL-4) 干扰的情况下人肾癌细胞系 ACHN 中磷酸化靶标的免疫-PRM 检测数据和相应的蛋白印迹结果。细胞用 40 ng/ml 人源白细胞介素-4 (hIL-4)#8919 处理 20 分钟后再收集。对于 iPRM 实验，ACHN 细胞蛋白用胰蛋白酶消化，随后将 100 µg ACHN 胰蛋白酶肽与用重同位素标记的肽混合在一起，以作为内部标准品。使用以下每种 CST 抗体 (5 µg) 进行多重免疫沉淀。AKT S473 (#4060), CDK1/2/3 Y15 (#4539), PRAS40 T246 (#2997), STAT3 Y705(#9145), STAT5A/B Y694 (#9314), STAT6 Y641 (#9364), ERK1 T202/Y204(#4370), ERK2 T185(#4370), ERK2 T185 (#4370), Jun S73(#3270). 在免疫富集之后，使用 Q Exactive™ 质谱仪对肽进行多重 PRM 分析。随后从 Skyline 中提取峰面积，并根据肽轻重链比例计算肽浓度。免疫捕获和 PRM 分析重复进行三次。用于 iPRM 实验的抗体也用于蛋白印迹实验。对于每种印迹，往 4%-20% 的 SDS-PAGE 梯度凝胶上上样 20 微克对照和经处理的 ACHN 细胞的蛋白提取物。在转移到硝酸纤维素膜上之后，使用稀释比为 1:1000 的磷酸化特异性抗体检测蛋白。

在进行 PRM（顶排）和免疫 PRM（底排）分析后，比较从 Skyline 提取的、有关 Jun (S73) 中磷酸肽 LAS*PELER++ 的各种浓度峰。从直接注射 1µg 经胰蛋白酶消化的 SKBR3 裂解物（顶排；PRM）或从对 100 µg SKBR3 肽进行免疫沉淀后再注射（底排；iPRM）的 Skyline 中提取碎片离子波峰 (y7-98+, y6-98+, y5+, y3+, y7-98++, y6-98++)，其中质量公差为 0.05 m/z。SKBR3 细胞裂解物中的肽浓度为 0、0.2、2、20、200、2000 amol/µg（从左到右）。肽的检测下限 (LLOD) 从使用 PRM 方法时的 2000 amol/µg 升高到使用 iPRM 工作流程时的 2 amol/µg。

在进行 PRM（顶排）和免疫 PRM（底排）分析后，比较从 Skyline 提取的、有关 Jun (S73) 中磷酸肽 LAS*PELER++ 的各种浓度峰。从直接注射 1µg 经胰蛋白酶消化的 SKBR3 裂解物（顶排；PRM）或从对 100 µg SKBR3 肽进行免疫沉淀后再注射（底排；iPRM）的 Skyline 中提取碎片离子波峰 (y7-98+, y6-98+, y5+, y3+, y7-98++, y6-98++)，其中质量公差为 0.05 m/z。SKBR3 细胞裂解物中的肽浓度为 0、0.2、2、20、200、2000 amol/µg（从左到右）。肽的检测下限 (LLOD) 从使用 PRM 方法时的 2000 amol/µg 升高到使用 iPRM 工作流程时的 2 amol/µg。

磷酸化 STAT6 (Y641) 肽 GY*VPATIK 的线性（顶部）和对数空间（底部）免疫-PRM 反应曲线数据。在 100 µg 胰蛋白酶肽背景下，对数量递增的 10 重同位素标记合成肽进行免疫沉淀，以进行多点实验，其中肽来源于乳腺癌细胞系 SKBR-3，加入的轻链肽作为内部标准品。在免疫沉淀之后，在 Q Exactive™ 质谱仪上分析肽。通过提取 Skyline 中的片段肽面积来确定肽丰度。通过计算每条肽的 3-6 个丰富片段离子的峰面积比（重链/轻链）来进行定量。目前的结果图显示了一条磷酸肽的代表性数据，同时进行了一个含 10 个靶标的多重 PRM 实验。误差条表示三次捕获和 PRM 重复次数的最大和最小峰面积比。反应曲线表明磷酸肽 GY*VPATIK 中超过 4 个数量级的线性范围，LLOQ 为 0.039 fmol/100 µg。

磷酸化 STAT6 (Y641) 肽 GY*VPATIK 的线性（顶部）和对数空间（底部）免疫-PRM 反应曲线数据。在 100 µg 胰蛋白酶肽背景下，对数量递增的 10 重同位素标记合成肽进行免疫沉淀，以进行多点实验，其中肽来源于乳腺癌细胞系 SKBR-3，加入的轻链肽作为内部标准品。在免疫沉淀之后，在 Q Exactive™ 质谱仪上分析肽。通过提取 Skyline 中的片段肽面积来确定肽丰度。通过计算每条肽的 3-6 个丰富片段离子的峰面积比（重链/轻链）来进行定量。目前的结果图显示了一条磷酸肽的代表性数据，同时进行了一个含 10 个靶标的多重 PRM 实验。误差条表示三次捕获和 PRM 重复次数的最大和最小峰面积比。反应曲线表明磷酸肽 GY*VPATIK 中超过 4 个数量级的线性范围，LLOQ 为 0.039 fmol/100 µg。

CDK1/2/3 (Y15) 中磷酸肽 IGEGTY*GVVYK 的免疫 PRM 可重复性数据（5 天）。在 100 µg 胰蛋白酶肽背景下，加入三个水平（500 fmol、20 fmol、0.8 fmol 作为高、中、低水平）的 10 重同位素标记肽来制备样品，其中肽来源于乳腺癌细胞系 SKBR-3，加入的轻链肽作为内部标准品。分 5 个不同天数单独进行三次富集，以测量可重复性。在免疫沉淀之后，在 Q Exactive™ 质谱仪上分析肽。从 Skyline 中提取每条肽的 3-6 个丰富片段的峰面积，并根据轻链和重链肽的片段总和来计算峰面积比。测量起始浓度不同的每条肽的平均实验内和实验间变异系数 (CV)。总 CV 为实验内和实验间 CV 的平方和的平方根。对于结果图中所示的磷酸肽 IGEGTY*GVVYK，所有 CV 均在 10% 之内。对于含 10 个靶标的多重 iPRM 实验中的其他肽，所有 CV 均在 20% 之内。

CDK1/2/3 (Y15) 中磷酸肽 IGEGTY*GVVYK 的免疫 PRM 可重复性数据（5 天）。在 100 µg 胰蛋白酶肽背景下，加入三个水平（500 fmol、20 fmol、0.8 fmol 作为高、中、低水平）的 10 重同位素标记肽来制备样品，其中肽来源于乳腺癌细胞系 SKBR-3，加入的轻链肽作为内部标准品。分 5 个不同天数单独进行三次富集，以测量可重复性。在免疫沉淀之后，在 Q Exactive™ 质谱仪上分析肽。从 Skyline 中提取每条肽的 3-6 个丰富片段的峰面积，并根据轻链和重链肽的片段总和来计算峰面积比。测量起始浓度不同的每条肽的平均实验内和实验间变异系数 (CV)。总 CV 为实验内和实验间 CV 的平方和的平方根。对于结果图中所示的磷酸肽 IGEGTY*GVVYK，所有 CV 均在 10% 之内。对于含 10 个靶标的多重 iPRM 实验中的其他肽，所有 CV 均在 20% 之内。