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9145
Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145

引用 (1564)
筛选器:
  1. WB
  2. IP
  3. IHC
  4. IF
  5. F
  6. ChIP
Western Blotting Image 1: Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb

使用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb,对 IFN-α 处理的 Jurkat 细胞、Hela 细胞(左)、经 EGF 处理的 A431 细胞(右)提取物进行蛋白质印迹分析。注意,抗体可检测 A431 的基础磷酸化 Stat3。

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在 Leica® BOND™ Rx 上使用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人肺神经内分泌癌进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 2: Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb

在 Leica® BOND™ Rx 上使用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人结肠腺癌进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 1: Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb

使用 Phosho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的 Apc (min/+) 小鼠肠道进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 2: Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb

使用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb,对未经处理(左)或经 λ 磷酸酶处理(右)的石蜡包埋的人乳腺癌(尤其是内皮细胞)进行免疫组织化学分析。

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使用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人肺癌进行免疫组织化学分析,显示出胞核定位。

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使用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb on SignalSlide® HeLa -/+ IFNa IHC Controls #55861(对未经处理(左)或经 Human Interferon-α1 (hIFN-α1) #8927 处理(右)的石蜡包埋的 Hela 细胞沉淀物)进行免疫组织化学分析。

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对 IFN-α 处理(左)或未经处理(右)Hela 细胞进行共聚焦免疫荧光分析,用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb(绿色)标记。

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使用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb(实线)或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(虚线)对未经(蓝色)或已经 IFNα(50 ng/ml,15 分钟;绿色)处理的 U266 细胞进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。

Chromatin Immunoprecipitation Image 1: Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb

使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005,对饥饿过夜后,用 IL-6(100 ng/ml;30 分钟)处理的 Hep G2 细胞中提取的交联染色质,在加入 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb 后,进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制成 DNA 库。结果图显示在 IRF1 内结合,IRF1 是 Phospho-Sata3 的一种已知靶标基因(参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他结果图)。如需了解其他 ChIP-seq 情况,请下载产品说明书。

Chromatin Immunoprecipitation Image 2: Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb

使用 SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383,对饥饿过夜后,用 IL-6(100 ng/ml)处理30 分钟)的 Hep G2 细胞中提取的交联染色质,在加入 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 后,进行染色质免疫沉淀分析。使用 SimpleChIP® Human c-Fos Promoter Primers #4663、human IRF1 promoter primers 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行量化。每份样品的免疫沉淀 DNA 含量,用染色质投入总量(相当于 1)相对应的信号进行表示。

Chromatin Immunoprecipitation Image 3: Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb

使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003,对饥饿过夜后,用 IL-6(100 ng/ml;30 分钟)处理的 Hep G2 细胞中提取的交联染色质,在加入 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 后,进行染色质免疫沉淀。使用 human IRF-1 promoter primers、SimpleChIP® Human c-Fos Promoter Primers #4663 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 并通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每份样品的免疫沉淀 DNA 含量,用染色质投入总量(相当于 1)相对应的信号进行表示。

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支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 79, 86
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

为了获得最佳的 ChIP 和 ChIP-seq 结果,每次免疫沉淀使用 5 μl 抗体和 10 μg 染色质(大约 4 x 106 个细胞)。该抗体已使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kits 进行验证。

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:2000
免疫沉淀 1:100
IHC-Leica® Bond™ 1:100 - 1:400
免疫组织化学(石蜡) 1:100 - 1:400
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:100 - 1:200
流式细胞术 1:100 - 1:400
染色质免疫沉淀法 1:100
ChIP-seq 1:100

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS,将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。

    注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein A Agarose Beads:(#9863)。
  5. 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  6. ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。
  6. 在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清(可选)

  1. 涡旋振荡,以混合磁珠。
  2. 添加 10–30 µl 的 50% Protein A agarose beads 混悬液至 200 µl 细胞裂解物中 (1 mg/ml)。
  3. 在 4°C 下,旋转孵育 30–60 分钟。
  4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀

  1. 将一抗(按产品说明书中推荐的合适稀释比例配制)加入到浓度为 1 mg/ml 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下,旋转孵育过夜。
  2. 添加 protein A 琼脂糖(10–30 µl 的 50% 珠浆)。在 4°C 下,旋转孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​于 2008 年 12 月 

修订于 2018 年 4 月

实验步骤编号:409

免疫组织化学 (Leica® BOND™)

:请参阅产品数据表或产品网页,了解合适的抗体稀释度^。

  步骤 试剂 时间/温度
1 脱蜡 BOND™ Dewax Solution、100% 乙醇、BOND™ Wash Solution 预编程的 Leica® BOND™ 
2 抗原修复  BOND™ Epitope Retrieval ER2 Solution 20 分钟,100˚C | 实验步骤:用 ER2 进行 20 分钟的热诱导表位修复 (HIER)
3 过氧化物封闭液 Refine Detection Kit Peroxide Block* 5 分钟
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 0:00 分钟
4 蛋白封闭液(可选) #5425 NGS 或 #15019 Animal-Free Blocking Solution   20 分钟 
5 一抗^ 用 #8112 SignalStain® Antibody Diluent 稀释 30 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 2:00 分钟
不适用 Post Primary Mouse Linker Refine Detection Kit Post Primary*  不适用 
6 二次检测 Refine Detection Kit Polymer*  10 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution/Deionized Water 定制(参见下文)
7a 可视化 Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*  0:00 分钟 
7b 可视化 Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*  10 分钟 
  洗涤 去离子水 3x 0:00 分钟
8 复染 Refine Detection Kit Hematoxylin*  5 分钟 
  洗涤 去离子水 0:00 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  0:00 分钟 
  洗涤 去离子水 0:00 分钟 
9 脱水(离线):    
  在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。  
  在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。  
  在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。  
10 用盖玻片和 #14177 SignalStain® Mounting Medium 封片。  
       
  可选订制洗涤: BOND™ Wash Solution 2:00
    BOND™ Wash Solution 分液器类型:开放式 0:00
    BOND™ Wash Solution 2:00
    BOND™ Wash Solution 分液器类型:开放式 0:00
    BOND™ Wash Solution 0:00
    去离子水 0:00

*BOND™ Polymer Refine Detection Kit(货号:DS9800)中所含的试剂

LEICA® 是 Leica Microsystems IR GmbH 的注册商标。

BOND™ 是 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 的商标。CST 和 Leica Microsystems IR GmbH 或 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 之间没有附属或赞助关系。

发布​于 2018 年 8 月 

修订于 2018 年 9 月

实验步骤编号:1444

免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X EDTA 修复液:要制备 250 mL 的 1X EDTA 修复液,使用 225 mL 的 dH2O 稀释 25 ml 的 SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747)。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备4 mL 的 dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于 EDTA:将切片浸入 1X EDTA 修复液中,再放入微波炉中加热直到沸腾;继续保持 15分钟的亚沸腾温度 (95°-98°C)。无需冷却。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:284

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 甲醇,100%
  4. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  6. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:

  7. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意:甲醛有毒性,仅可在通风橱中使用
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 甲醇通透步骤:在细胞上覆盖冰冷的 100% 甲醇(使用足够的甲醇完全覆盖至 3–5 mm,不要让其干燥),并在 –20°C 下用甲醇孵育 10 分钟,同时用 1X PBS 漂洗 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜
  6. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  7. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  8. 按步骤 6 使用 1X PBS 漂洗。
  9. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
  10. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2010 年 12 月

实验步骤编号:32

针对兔抗体的甲醇通透实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要制备 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。
  5. 建议使用抗兔二抗:
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408

注意:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经流式细胞术验证的细胞染料完整列表

B. 固定

:固定前,应分离黏附细胞或组织,并放在单细胞悬浮液中。

注意:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者,细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗(按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。
  7. 室温孵育 30 分钟。避光保存。
  8. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:404

针对以下产品:SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383

所需的试剂

包括的试剂:

  1. Glycine Solution (10X) #7005
  2. ChIP Sonication Cell Lysis Buffer (2X) #96529
  3. ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer #28778
  4. ChIP Buffer (10X) #7008
  5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
  6. 5 M NaCl #7010
  7. ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006
  8. DNA Binding Buffer #10007
  9. DNA Wash Buffer(使用前添加 4x 体积乙醇)#10008
  10. DNA Elution Buffer #10009
  11. DNA Purification Columns #10010
  12. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
  13. RNase A (10 mg/ml) #7013
  14. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
  15. SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
  16. SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
  17. Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
  18. Normal Rabbit IgG #2729

未包括的试剂:

  1. Magnetic Separation Rack #7017 / #14654
  2. Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
  3. Nuclease-free Water #12931
  4. SimpleChIP® 通用 qPCR 预混液#88989
  5. 乙醇 (96-100%)
  6. 甲醛(37% 母液)
! 这就表示在实验流程中基于免疫沉淀制备物(IP 制备物)数量的容积改变是重要的一步。一份 IP 制备物是指 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 离体的组织。
!! 这就表示,进行操作前稀释缓冲液是重要的一步。
安全停止 如果需要停止,这是实验步骤中的一个安全停止点。

I. 组织交联和样品制备

收获组织时,去除样品中不需要的物质,如脂肪和坏死物质。组织可以立即处理和交联,或放在干冰上冷冻供后续处理。为获得最佳 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。应额外处理 5 mg 组织用于“分析染色质消化和浓度”,并用作输入染色质(第四部分)。不同组织类型的染色质产率不尽相同,每次免疫沉淀时,某些组织可能需要超过 25 mg。

一次染色质制备量规定为 100 至 150 mg 组织。对于某些组织类型,这种建议的组织量可能会导致低产率,但在超声处理过程中可确保高效的染色质碎裂。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息,请参见附录 A。

在开始之前:

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中染色质制备物的数量按比例添加。

  • 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 Glycine Solution (10X) #7005。确保 PIC 完全解冻。
  • 对于每份染色质制备物,配制 3 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC,并将它们放在冰上。
  • 对于每份染色质制备物,配制 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer(0.5 ml 2X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer #96529 + 0.5 ml 水)+ 5 µl 200X PIC,并将它们放在冰上。
  • 对于每份染色质制备物,配制 28 µl 37% 甲醛,并保存在室温下。或者,可以使用 62.5 µl 16% 不含甲醇的甲醛。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。
  1. 称重新鲜或冷冻的组织样品。对于每份染色质制备物,使用 100-150 mg 组织。
  2. 将组织样品放在皮氏培养皿中,并用干净的手术刀或剃须刀片切成 1-2 mm 的方块。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
  3. 将切好的组织转移到 15 ml 锥形试管中,对于每份染色质制备物,加入 1 ml 冰冷的 PBS + PIC。
  4. 为了让蛋白与 DNA 交联,每 1 ml PBS + PIC中加入28 μl 37% 甲醛或 62.5 µl 16% 不含甲醇的甲醛,并在室温下放置至少 10 分钟。甲醛的最终浓度是 1%。对于组蛋白修饰 ChIP,固定 10 分钟即可;对于转录因子 ChIP,我们建议固定 10 至 30 分钟;而对于转录辅因子 ChIP,我们则建议固定 30 分钟(参见附件 B 中的图 7)。
  5. 每 1 ml PBS + PIC 加入 100 μl 10X Glycine #7005 来终止交联。混合后放在冰上孵育 5 分钟。
  6. 在 4°C 下以 1,200 x g 的离心力离心分离组织 5 分钟。
  7. 对于每份染色质制备物,去除上清液,并用 1 ml 冰冷的 PBS + PIC 洗涤。
  8. 在 4°C 下以 1,200 x g 的离心力离心分离 5 分钟。
  9. 重复一次步骤 7 和 8。
  10. 对于每份染色质制备物,去除上清液,并在 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中重悬组织。(安全停止)或者,样本裂解前在 -80°C 条件下最多可保存 3 个月。
  11. 使用切割移液管吸头将组织悬浮液转移到杜恩斯匀浆器中。
  12. 使用完全配套的研杵(类型 A)捣碎 20 次以分散组织块或直至观察到没有组织块。
  13. 将细胞悬浮液转移到 1.5 ml 试管中,随后立即进行胞核制备和染色质碎裂(第三部分)。

II. 细胞培养物交联和样品制备

为获得最佳 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用大约 4 x 106 个细胞。对于 HCT 116 细胞,这相当于 15 cm 培养皿所含细胞(在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90%)的 1/3。应额外处理 1 x 106 个细胞用于“分析染色质消化和浓度”,并用作输入染色质(第四部分)。

一次染色质制备量规定为 1 x 107 至 2 x 107 个细胞。对于某些细胞类型,这种建议的细胞量可能会导致低产率,但在超声处理过程中可确保高效的染色质碎裂。

在开始之前:

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中使用的 15 cm 组织培养皿(或 20 ml 悬浮细胞)的数量按比例增加。

  • 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 Glycine Solution(10X) #7005。确保 PIC 完全解冻。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿(或 20 ml 悬浮细胞),配制 2 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 10 μl 200X PIC,并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿(或 20 ml 悬浮细胞),配制 40 ml PBS,并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 细胞培养皿(或 20 ml 悬浮细胞),配制 540 μl 37% 甲醛,并保存在室温下。或者,可以使用 1.25 ml 16% 不含甲醇的甲醛。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。
  • 对于每份染色质制备物,配制 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer(0.5 ml 2X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer #96529 + 0.5 ml 水)+ 5 µl 200X PIC。
  1. 为让蛋白与 DNA 交联,每个含 20 ml 培养基(或 20 ml 悬浮细胞)的 15 cm 培养皿添加 540 μl 37% 甲醛或 1.25 ml 16% 不含甲醇的甲醛。如要对悬浮细胞进行最佳固定,固定时的细胞密度应低于 0.5 x 106 个细胞/ml。短暂旋转混匀并置于室温下孵育 10 分钟。甲醛的最终浓度是 1%。添加甲醛可能导致培养基颜色发生变化。
  2. 每个含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 2 ml 10X 甘氨酸,稍微涡旋混合,并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能导致培养基颜色发生变化。
  3. 对于悬浮细胞:
    1. 将细胞转移到 50 ml 锥形试管中,在 4℃ 下以 1,000 x g 的离心力离心分离 5 分钟,随后沉淀物用 20 ml 冰冷的 PBS 洗涤两次。去除 PBS 后继续进行步骤 3b。或者,细胞沉淀物可以放在干冰上冷冻,并保存在 -80°C 下供后续使用。
    2. 对于每份染色质制备物,在每 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中重悬最多 2 x 107 个细胞,并立即进行胞核制备和染色质碎裂(第三部分)。(安全停止)或者,样本在 -80°C 下最多保存 3 个月。
  4. 对于黏附细胞:
    1. 去除培养基,细胞用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤两次,每次完全去除培养皿中的洗液。
    2. 每个 15 cm 培养皿添加 2 ml 冰冷的 PBS + PIC。将细胞刮入冷的缓冲液中。将所有培养皿的细胞混合放入一个 15 ml 锥形试管。
    3. 细胞在 4°C 下以 1,000 x g 的离心力离心分离 5 分钟。去除 PBS 后继续进行步骤 4d。或者,细胞沉淀物可以放在干冰上冷冻,并保存在 -80°C 下供后续使用。
    4. 对于每份染色质制备物,在每 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中重悬最多 2 x 107 个细胞,并立即进行胞核制备和染色质碎裂(第三部分)。(安全停止)或者,样本在 -80°C 下最多保存 3 个月。

III. 胞核制备和染色质碎裂

一次染色质制备量规定为 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个组织培养细胞。可以同时进行多份染色质制备,只要相应增加缓冲液用量并对 1 ml 样品进行超声处理。超声处理所使用的细胞数量和样品量对于产生合适大小的染色质片段非常关键。

在开始之前:

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中染色质制备物的数量按比例添加。

  • 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化。
  • 对于每份染色质制备物,配制 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer(0.5 ml 2X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer #96529 + 0.5 ml 水)+ 5 µl 200X PIC。
  • 对于每份染色质制备物,配制 1 ml ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer #28778 + 5 µl 200X PIC。
  1. 将在第一部分或第二部分配制的 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中的细胞悬浮液放在冰上孵育 10 分钟。
  2. 在 4°C 下以 5,000 x g 的离心力让细胞沉淀 5 分钟。对于每份染色质制备物,去除上清液,然后在 1 ml 冰冷的 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中再次重悬沉淀物。
  3. 细胞悬浮液放在冰上孵育 5 分钟。在 4°C 下以 5,000 x g 的离心力让细胞沉淀 5 分钟。请注意,超声处理之前,交联细胞可能并未完全裂解。
  4. 对于每份染色质制备物,在 1 ml 冰冷的 ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer #28778 + PIC 中重悬细胞,然后放在冰上孵育 10 分钟。将 1 ml 细胞悬浮液转移到大小合适的试管中进行超声处理。请注意,超声处理之前,交联细胞和胞核可能并未完全裂解。
  5. 通过超声处理碎片化染色质超声处理条件可能需要通过测试不同超声波仪功率设置和超声处理时长来凭经验确定。最佳超声处理条件可产生 60-90 % 小于 1kb 的染色质片段。较长的交联时间可能会使小于 1 kb 的片段比例降低至 30-60%,(见附件 B 中的图 7 和附件 C 中的图 8)。使用能产生所需染色质片段长度需要的最少超声处理循环次数,因为过度超声处理会因染色质苛刻处理而导致信号减弱或丢失。
    • 对于每份声处理样品,我们建议每 1 ml ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer 使用 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个细胞。对更多和/或更浓的细胞进行超声处理会降低染色质碎裂的效率。
    • 使用配有 1/8 英寸微探头的 Branson Digital Sonifier D250 探头超声波仪时,应用 8 分钟的 1 秒开/1 秒闭声处理周期(超声处理时间为 4 分钟)和 50% 振幅通常能产生良好的碎裂性能和染色质免疫沉淀效率。
    • 请确保在超声处理时以及各处理步骤之间将含有染色质的试管置于冰水槽中,以便让染色质样品在超声处理期间保持冷却。切勿让探头接触到试管底部或试管壁。如果染色质样品在超声处理期间起泡,则停止超声处理并调整试管位置。
  6. 在 4°C 下用微量离心机以 21,000 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。
  7. 将上清液转移至新试管。(安全停止) 这是交联的染色质制备物,应当置于 -80 ℃ 下贮存直至进一步使用。取出 50 μl 染色质制备物进行染色质消化和浓度分析(第四部分)。

IV. 分析染色质碎裂和浓度(建议步骤)

  1. 向 50 μl 染色质样品(在第 三 部分的步骤 7 中制备)中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A#7013。涡旋混合,并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
  2. 向每份经 RNase A 消化的样品添加 2 μl Proteinase K #10012。涡旋混合并在 65℃ 下孵育样品 2 小时。
  3. 按第七部分中所述的步骤,使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA。(安全停止)DNA 样本在 -20°C 条件下最多可保存 6 个月。
  4. DNA 纯化后,取 10 μl 样品并通过在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来确定 DNA 片段大小。DNA 拖尾预计为 200 bp 到几 kb(见附件 C 中的图 7)。大约 60-90% 的所有 DNA 片段应小于 1 kb。请参见附件 B 了解超声处理条件的优化。
  5. 使用分光光度计测量 DNA 浓度。在理想情况下,DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

五、染色质免疫沉淀法

为获得最佳 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用大约 5-10 μg 经超声处理的交联染色质(第 四 部分中确定的量)。这应大致相当于用 25 mg 离散组织或 4x106 个组织培养细胞制备的一份 100 µl 免疫沉淀制备物。在添加抗体之前,通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但如果每次免疫沉淀需要多于 100 µl 的染色质,则必须将交联染色质制备物按 1:4 的稀释比例在 1X ChIP 缓冲液中稀释。在这种情况下,无需添加 蛋白 G 磁珠,尽管延长用微珠孵育的时间比较有用。

在开始之前:

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。

  • 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。
  • 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008,确保 SDS 完全溶解。
  • 融化碎裂的染色质制备物(在第 三 部分的步骤 7 中制备)并放在冰上。
  • 配制低盐洗液:每次免疫沉淀配制 3 ml 1X ChIP Buffer(300 µl 10X ChIP Buffer #7008 + 2.7 ml 水)。置于冰上。
  • 配制高盐洗液:每次免疫沉淀配制 1 ml 1X ChIP Buffer(100 µl 10X ChIP Buffer #7008 + 900 µl 水)+ 70 µl 5M NaCl #7010。置于冰上。
  1. 在一根试管中,配制足够的 1X ChIP Buffer + PIC,用于将经超声处理的染色质稀释至能进行所需次数的免疫沉淀。对于每次免疫沉淀,染色质(5-10 µg DNA)用 1X ChIP Buffer + PIC 稀释至总量为 500 µl。要进行高效的免疫沉淀,必须以 1:4 或更高的稀释因数在 1 x ChIP buffer 中稀释染色质。将混合物置于冰上。确定免疫沉淀的次数时,记得计入阳性对照样品 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb#4620 和阴性对照样品 Normal Rabbit IgG antibody #2729
  2. 取出 10 μl 稀释的染色质样品并将其转移至微量离心管。这将作为 2% 样品输入对照,该样品在后续使用之前可以置于 -20℃ 下贮存(第六部分的步骤 1 )。
  3. 对于每次免疫沉淀,将 500 μl 稀释的染色质分装到 1.5 ml 微量离心管中,并加入免疫沉淀抗体。每次免疫沉淀所需的抗体用量有所不同,应按照制造商的建议使用。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb#4620,向免疫沉淀样品加入 10 μl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729,向免疫沉淀样品加入 1 µl (1 µg) 至 2 µl (2 µg)。免疫沉淀样品在 4℃ 下振荡孵育 4 小时至过夜。
  4. 注意:对于 Cell Signaling Technology 的多数抗体,每份免疫沉淀样品使用 1-2 µg 时的效果最佳。如有多份不同浓度的样品,最好让阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

  5. 轻轻涡旋来重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。每次免疫沉淀反应立即添加 30 µl Protein G Magnetic Beads,并在 4°C 下振荡孵育 2 小时。或者,微珠可以添加到步骤 3 中的过夜抗体孵育液中,但这可能会增强背景信号。
  6. 在每次免疫沉淀中,将试管放在磁分离架上让 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清,然后小心地移除上清液。
  7. Protein G Magnetic Beads 通过添加 1 ml 低盐洗液到微珠中进行洗涤,并在 4°C 下振荡孵育 5 分钟。再重复步骤 5 和 6 两次,以确保总共进行 3 次低盐洗涤。
  8. 向微珠中添加 1 ml 高盐洗液并且在 4℃ 下转动孵育 5 分钟。
  9. 在每次免疫沉淀中,将试管放在磁分离架上让 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清,然后小心地移除上清液。立即进入第六部分。

VI. 将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来并解交联

在开始之前:

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。

  • 取 2X ChIP Elution Buffer #7009 放在 37°C 水浴槽中加热,并确保 SDS 溶解。
  • 将水浴或热混合仪设为 65℃。
  • 配制每次免疫沉淀所需的 150 µl 1X ChIP Elution Buffer(75 µl 2X ChIP Elution Buffer #7009 + 75 µl 水)和 2% 输入样品。
  1. 添加 150 µl 1X ChIP Elution Buffer 到 2% 输入样品试管中,并放在室温下直至进行步骤 7。
  2. 向每份 IP 样品中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液。
  3. 在 65°C 下,通过轻轻涡旋 (1,200 rpm) 将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来,持续 30 分钟。这个步骤最好使用恒温混匀仪,但在 65°C 水浴槽中频繁混合也可。或者,可以在室温下转动洗脱,但是可能不会完全洗脱。
  4. 样品以 10,000 x g 的离心力短暂离心分离 10 秒钟,以便去除微量离心管盖上的蒸发样品。
  5. 将试管放在磁分离架上让 Protein G Magnetic Beads 沉淀,并等待 1-2 分钟让溶液变澄清。
  6. 小心地将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管。
  7. 要解交联,向所有试管(包括步骤 1 中的 2% 输入样品)加入 6 µl 5M NaCl #7010 和 2 µl Proteinase K #10012,并在 65°C 下孵育 2 小时。这次孵育可以延长过夜。
  8. 立即进入第七部分。(安全停止) 或者,样本在 -20°C 条件下最多可保存 4 天。但为了避免形成沉淀物,请确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前,将样品加热到室温(第 七 部分,步骤 1)。

VII. 使用离心柱纯化 DNA:

在开始之前:

  • (!!) 使用前添加 24 ml 乙醇 (96-100%) 到 DNA Wash Buffer #10008 中。此操作仅需在第一次DNA纯化前进行。
  • 为第 六 部分的每份 DNA 样品准备一根 DNA 纯化离心柱和收集管 #10010
  1. 添加 750 µl DNA Binding Buffer #10007 到每份 DNA 样品中,涡旋片刻。
    • 对于每 1 体积样品,应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。
  2. 对于步骤 1 中的每份 DNA 样品,转移450 μl 到收集管中的 DNA 离心柱上。
  3. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
  4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  5. 对于步骤 1 中的每份 DNA 样品,转移剩余的 450 μl 到收集管中的离心柱上。重复步骤 3 和 4。
  6. 添加 750 µl DNA Wash Buffer #10008 到收集管中的离心柱上。
  7. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
  8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  9. 用微量离心机以 14,000 rpm 的转速离心分离 30 秒钟。
  10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
  11. 添加 50 μl DNA Elution Buffer #10009 到每根离心柱上,并放在 1.5 ml 干净的微量离心管中。
  12. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒,以洗脱 DNA。
  13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。(安全停止)样本在 -20°C 下最多保存 6 个月。

八、通过 PCR 定量 DNA:

建议:

  • 使用过滤式吸液头来尽量减少污染风险。
  • 该试剂盒中的对照引物对人或小鼠 RPL30 基因(#7014#7015)具有特异性,可用于标准 PCR 或定量实时 PCR。如果用户对其他物种进行 ChIP,建议用户设计针对 DNA 的相应引物,并确定最佳 PCR 条件。
  • 建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。
  • PCR 引物选择至关重要。应当严格遵循以下标准设计引物:
    引物长度: 24 个核苷酸
    最佳 Tm: 60℃
    最佳 GC: 50%
    扩增子尺寸: 150 至 200 bp(标准 PCR)
      80 至 160 bp(实时荧光定量 PCR)

标准 PCR 方法:

  1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。这些样品应当包括 2% 样品输入对照、阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品,和未加入 DNA 的试管以排除 DNA 污染。
  2. 向每支管中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物,配置时多配置两个样本的试剂以弥补分管时的体积损耗。向每支反应管中添加 18 μl 主混合物。
    试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
    无核酸酶的 H2O 12.5 μl
    10X PCR 缓冲液 2.0 μl
    4mM dNTP 混合物 1.0 μl
    5 μM RPL30 引物 2.0 μl
    Taq DNA 聚合酶 0.5 μl
  4. 启动以下 PCR 反应程序:
    1. 初始变性:在 95°C 下进行 5 分钟
    2. 变性:在 95°C 下进行 30 秒钟
    3. 退火:在 62°C 下进行 30 秒钟
    4. 延伸:在 72°C 下进行 30 秒钟
    5. 重复步骤 b-d,共循环 34 次。
    6. 最终延伸:在 72°C 下进行5 分钟
  5. 从每支反应管中取出 10 μl PCR 产物,使其与 100 bp DNA 标准品同时进行 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳,以进行分析。人 RPL30 #7014 和小鼠 RPL30 #7015 的 PCR 产物的预期大小分别是 161 bp 和 159 bp。

实时荧光定量 PCR 方法:

  1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应当包括阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的试管和 2% 输入对照组染色质 DNA 的连续稀释物(未稀释、1:5、1:25、1:125),以生成标准曲线并测定扩增效率。
  2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。每次 PCR 反应设置 2-3 次复制。添加足够试剂来补充容积损失。向每个 PCR 反应管或孔中添加 18 μl 反应混合物。(安全停止)如有必要,用铝箔纸盖住平板以避光,并在 4°C 下最多保存 4 小时,或在 -20°C 下过夜,直到机器可以使用。
    试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
    无核酸酶的 H2O 6 μl
    5 μM RPL30 引物 2 μl
    SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 10 μl
  4. 启动以下 PCR 反应程序:
    a. 初始变性 95℃ 3 分钟
    b. 变性 95℃ 15 秒
    c. 复性和延伸: 60℃ 60 秒
    d. 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。  
  5. 使用实时 PCR 仪的自带软件,分析定量 PCR 结果。或者,可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式,手动计算 IP 效率。采用这种方法,从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。

    输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样品 - C[T] 免疫沉淀样品)
    C[T] = CT = PCR 反应的平均循环阈值

九、NG-Sequencing文库构建

用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库,请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。如要在 Illumina® 平台上进行测序,我们建议使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 及其相关索引引物 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538

建议:

  • 对于转录因子或辅因子 ChIP-seq,使用至少 5 ng ChIP 富集的 DNA 和 10 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
  • 对于总组蛋白和组蛋白修饰或样品输入对照,开始时使用至少 50ng ChIP 富集的 DNA 和 6 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
  • 要对全部靶标类型的 ChIP-富集的 DNA 构建文库,需对衔接子连接的 DNA 进行纯化,但无需进行大小选择。
  • 在构建 DNA 文库之后,使用 Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies,货号:G2938-90322)或通过与 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳,来检验 DNA 文库中衔接子二聚体(约 140 bp)是否存在。如果有接头蛋白二聚体,则重复清除 PCR 扩增物质。
  • 也可通过对已知阳性和阴性靶基因座使用 qPCR 和引物组来确认文库的质量。与阴性引物相比,阳性引物对仍然应当产生相同的高信号,如原始 qPCR 分析 ChIP 富集的 DNA 时所见。
  • 完成最终的纯化和质量检验后,制备浓度为 2-10 nM 的最终纯化文库样品以用于高通量测序。

附件 A:预期的染色质产量

从组织样品收获交联的染色质时,组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表提供用 100 mg 组织与 2 x 107 个 HCT 116 细胞制备的染色质的预期产量范围,以及实验步骤第 四 部分确定的预期 DNA 浓度。为获得最佳 ChIP 结果,我们建议每次免疫沉淀使用 5-10 μg 经超声处理的交联染色质。

组织/细胞 染色质总产率 预期 DNA 浓度
每 100 mg 组织使用 50 µg 150 µg/ml
每 100 mg 组织使用 25 µg 50 µg/ml
心脏 每 100 mg 组织使用 105 µg 20 µg/ml
HCT 116 100-150 μg/2 x 107 个细胞 100-150 μg/ml

附件 B:甲醛固定的优化

转录因子和辅因子结合染色质 DNA 没有结合组蛋白紧密。因此,它们在超声处理期间容易脱离染色质。在 ChIP 实验中,延长固定时间能捕获更多转录因子和辅因子,尤其是使用组织样品时。如图 7 所示,固定时间从 10 分钟延长至 30 分钟可能会减小染色质片段(左小图),但 ChIP-qPCR 表明,这会显著增加心脏组织中辅因子 RING1B 和 SUZ12 的富集(中间小图和右小图)。

通常,对于同时使用细胞和组织样品的组蛋白修饰 ChIP,10 分钟固定即可,而转录因子和辅因子可能需要长达 30 分钟的额外固定时间,尤其是使用组织样品时。

FIGURE 7. Mouse heart (H), brain (B), and liver (L) were cross-linked for 10 min or 30 min.

图 7. 使小鼠心脏 (H)、脑 (B) 和肝 (L) 细胞交联 10 分钟或 30 分钟,如图所示(左小图)。染色质制备后进行声处理,对 DNA 进行纯化并用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳来分离。在 ChIP-qPCR 检测(中间和右小图)中,使用 RING1B (D22F2) XP® 兔单克隆抗体 #5694 或 SUZ12 (D39F6) XP® 兔单克隆抗体 #3737 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Mouse HoxD10 Exon 1 Primers #7429、SimpleChIP® Mouse HoxA1 Promoter Primers #7341 和 SimpleChIP® Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为向阴性 GAPDH 基因座发出的标准化信号(等于 1)。

附件 C:染色质碎裂的优化

交联染色质 DNA 碎裂的最佳条件高度依赖于使用的细胞数量、样品体积、超声处理时长和超声波仪功率设置。对于每份经声处理的样品,我们建议每 1 ml ChIP 声处理胞核裂解缓冲液用 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个细胞。 以下是确定某种特定组织或细胞类型的最佳超声处理条件的实验步骤。

  1. 按照第一、二和三部分的说明,用 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个细胞制备交联胞核。在第三部分的步骤 4 之后停止,并如下所述继续。
  2. 通过超声处理碎片化染色质对于指定超声波仪,可以通过在规定功率设置(参见第 三 部分的步骤 5,以了解使用 Branson Digital Sonifier 250 探头超声波仪的最佳功率设置)下改变超声处理循环次数或时长来确定最佳超声处理条件。要确定最佳超声处理条件,设计一项超声处理时程实验,并在某个超声处理循环或时长后取出 50 µl 染色质样品。例如,每 1-2 分钟超声处理后取出染色质样品。
  3. 在 4°C 下用微量离心机以 21,000 x g 的离心力离心分离 10 分钟,以让染色质样品变澄清。
  4. 将上清液转移到新微量离心管中,并加入 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合,并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
  5. 向每份经 RNase A 消化的样品添加 2 μl Proteinase K #10012。涡旋混合并在 65℃ 下孵育样品 2 小时。
  6. 从每份样品中取 20 µl,并确定 DNA 片段大小。
  7. 选择能产生最佳 DNA 片段大小的超声处理条件,并用于第 三 部分步骤 5 中的染色质制备。如果未达到最佳超声处理条件,则增加或减少超声波仪的功率设置,并重复超声处理时程。

注意:使用不同样品类型和固定时间时,最佳超声处理条件也不同。使用产生所需长度染色质片段需要的最少超声处理循环次数。超过 80% 短于 500 bp 的总 DNA 片段表明,过分超声处理会导致染色质过度受损,并会降低免疫沉淀效率(见图 8,右小图)

  • 对固定 10 分钟的细胞进行超声处理时,最佳超声处理条件会产生 DNA 拖尾,其中含有约 90% 短于 1 kb 的 DNA 总片段(见图 8,左小图)。延长固定时间至 30 分钟会限制碎裂过程,从而产生 DNA 拖尾,其中含有约 60% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。
  • 对固定 10 分钟的组织进行超声处理时,最佳超声处理条件会产生 DNA 拖尾,其中含有约 60% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。延长固定时间至 30 分钟会限制碎裂过程,从而产生 DNA 拖尾,其中含有约 30% 短于 1 kb 的 DNA 总片段(见图 7,左小图)。
FIGURE 8. Chromatin immunoprecipitations were performed with 2 x 10^7 HCT 116 cells

图 8. 将 HCT 116 细胞交联 10 分钟,并对其进行规定时间的声处理(左小图)。DNA 按照 SimpleChIP® Plus 超声法染色体免疫共沉淀试剂盒 #56383 的第四部分的说明进行纯化,并用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳来分离出 20 µl 纯化的 DNA。如左小图所示,增加超声处理循环次数会减小染色质片段的大小。使用 SimpleChIP® Plus 超声法染色体免疫共沉淀试剂盒 #56383 对非磷酸化(活性)β-连环蛋白 (Ser33/37/Thr41) (D13A1) 兔单克隆抗体 #8814、TCF4/TCF7L2 (C48H11) 兔单克隆抗体 #2569 或正常兔 IgG #2729 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Human CaMK2D Intron 3 Primers #5111 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每份样品中免疫沉淀的 DNA 数量表示为与输入染色质总量相对应的信号(等于 100%;右小图)。如图所示,使用配有 1/8 英寸微探头的 Branson Digital Sonifier D250 探头超声波仪时,4 分钟的染色质声处理最佳。过度超声处理会明显有损辅因子 β-catenin 和包含染色质的转录因子 TCF4/TCF7L2 的富集。

附件 D:疑难排除指南

将交联时间缩短到 10-30 分钟的范围。减少每次超声处理的细胞/组织数量。进行超声处理时程。
问题 可能的原因 建议
1. 碎裂染色质的浓度过低。

细胞/细胞核裂解不完全。

染色质制备没有使用足够细胞。

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml,则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg,然后继续实验。

交联前,对单独平板上的细胞进行计数,以确定准确的细胞数量。

2. 染色质碎裂不足,且片段过大(超过 50% 的片段大于 1.5 kb)。

细胞可能已经过度交联。

处理了过多细胞/组织。

将交联时间缩短到 10-30 分钟的范围。减少每次超声处理的细胞/组织数量。进行超声处理时程。

3. 染色质过度碎裂(超过 90% 的片段小于 300 bp)。

超声处理条件太苛刻。

进行一次超声处理时程来找到进行相应超声处理的最小输出/时长。

4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。

加入到免疫沉淀的染色质不足,或染色质被过度超声处理。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

使用从交联并经超声处理的染色质中获得的纯化 DNA 来优化针对实验用引物组的 PCR 条件。为获得最佳 ChIP 结果,每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。

5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。

添加至 IP 反应的染色质或抗体不足,或者 IP 孵育时间过短。

蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。

确保每次免疫沉淀反应添加 5-10 µg 染色质和 10 µl 抗体,并用抗体孵育过夜,添加蛋白 G 微珠之后再孵育 2 小时。

在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳,同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。

6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。

添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者,添加至 IP 反应的抗体过多。

添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。

向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。每次 IP 将 Normal Rabbit IgG 缩减至1 µl/IP。

向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则,起始 DNA 数量的差异无法准确测量。

7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足。

添加至 IP 反应的抗体不足。

抗体不适用于 IP。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

通常,免疫沉淀反应需添加 1-5 µg 抗体;但准确的用量在很大程度上取决于具体抗体。

增加添加至 IP 反应的抗体量。寻找其他替代抗体。

发布​于 2017 年 3 月 

修订于 2018 年 6 月

实验步骤编号:1384

超声处理染色质免疫沉淀法实验步骤

针对以下产品:SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383

I. 组织交联和样品制备

收获组织时,去除样品中不需要的物质,如脂肪和坏死物质。组织可以立即处理和交联,或放在干冰上冷冻供后续处理。为获得最佳 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。应额外处理 5 mg 组织用于“分析染色质消化和浓度”,并用作输入染色质(第四部分)。不同组织类型的染色质产率不尽相同,每次免疫沉淀时,某些组织可能需要超过 25 mg。

一次染色质制备量规定为 100 至 150 mg 组织。对于某些组织类型,这种建议的组织量可能会导致低产率,但在超声处理过程中可确保高效的染色质碎裂。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息,请参见附录 A。

在开始之前:

  • 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 Glycine Solution (10X) #7005。确保 PIC 完全解冻。
  • 对于每份染色质制备物,配制 3 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC,并将它们放在冰上。
  • 对于每份染色质制备物,配制 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer(0.5 ml 2X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer #96529 + 0.5 ml 水)+ 5 µl 200X PIC,并将它们放在冰上。
  • 对于每份染色质制备物,配制 28 µl 37% 甲醛,并保存在室温下。或者,可以使用 62.5 µl 16% 不含甲醇的甲醛。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。
  1. 称重新鲜或冷冻的组织样品。对于每份染色质制备物,使用 100-150 mg 组织。
  2. 将组织样品放在皮氏培养皿中,并用干净的手术刀或剃须刀片切成 1-2 mm 的方块。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
  3. 将切好的组织转移到 15 ml 锥形试管中,对于每份染色质制备物,加入 1 ml 冰冷的 PBS + PIC。
  4. 为了让蛋白与 DNA 交联,每 1 ml PBS + PIC中加入28 μl 37% 甲醛或 62.5 µl 16% 不含甲醇的甲醛,并在室温下放置至少 10 分钟。甲醛的最终浓度是 1%。对于组蛋白修饰 ChIP,固定 10 分钟即可;对于转录因子 ChIP,我们建议固定 10 至 30 分钟;而对于转录辅因子 ChIP,我们则建议固定 30 分钟(参见附件 B 中的图 7)。
  5. 每 1 ml PBS + PIC 加入 100 μl 10X Glycine #7005 来终止交联。混合后放在冰上孵育 5 分钟。
  6. 在 4°C 下以 1,200 x g 的离心力离心分离组织 5 分钟。
  7. 对于每份染色质制备物,去除上清液,并用 1 ml 冰冷的 PBS + PIC 洗涤。
  8. 在 4°C 下以 1,200 x g 的离心力离心分离 5 分钟。
  9. 重复一次步骤 7 和 8。
  10. 对于每份染色质制备物,去除上清液,并在 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中重悬组织。
  11. 使用切割移液管吸头将组织悬浮液转移到杜恩斯匀浆器中。
  12. 使用完全配套的研杵(类型 A)捣碎 20 次以分散组织块或直至观察到没有组织块。
  13. 将细胞悬浮液转移到 1.5 ml 试管中,随后立即进行胞核制备和染色质碎裂(第三部分)。

II. 细胞培养物交联和样品制备

为获得最佳 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用大约 4 x 106 个细胞。对于 HCT 116 细胞,这相当于 15 cm 培养皿所含细胞(在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90%)的 1/3。应额外处理 1 x 106 个细胞用于“分析染色质消化和浓度”,并用作输入染色质(第四部分)。

一次染色质制备量规定为 1 x 107 至 2 x 107 个细胞。对于某些细胞类型,这种建议的细胞量可能会导致低产率,但在超声处理过程中可确保高效的染色质碎裂。

在开始之前:

  • 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 Glycine Solution(10X) #7005。确保 PIC 完全解冻。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿,配制 2 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 10 μl 200X PIC,并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿,配制 40 ml PBS,并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 细胞培养皿,配制 540 μl 37% 甲醛,并保存在室温下。或者,可以使用 1.25 ml 16% 不含甲醇的甲醛。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。
  • 对于每份染色质制备物,配制 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer(0.5 ml 2X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer #96529 + 0.5 ml 水)+ 5 µl 200X PIC。
  1. 为让蛋白与 DNA 交联,每个含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 540 μl 37% 甲醛或 1.25 ml 16% 不含甲醇的甲醛。短暂旋转混匀并置于室温下孵育 10 分钟。甲醛的最终浓度是 1%。添加甲醛可能导致培养基颜色发生变化。
  2. 每个含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 2 ml 10X 甘氨酸,稍微涡旋混合,并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能导致培养基颜色发生变化。
  3. 对于悬浮细胞:
    1. 将细胞转移到 50 ml 锥形试管中,在 4℃ 下以 1,000 x g 的离心力离心分离 5 分钟,随后沉淀物用 20 ml 冰冷的 PBS 洗涤两次。去除 PBS 后继续进行步骤 3b。或者,细胞沉淀物可以放在干冰上冷冻,并保存在 -80°C 下供后续使用。
    2. 对于每份染色质制备物,在每 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中重悬最多 2 x 107 个细胞,并立即进行胞核制备和染色质碎裂(第三部分)。
  4. 对于黏附细胞:
    1. 去除培养基,细胞用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤两次,每次完全去除培养皿中的洗液。
    2. 每个 15 cm 培养皿添加 2 ml 冰冷的 PBS + PIC。将细胞刮入冷的缓冲液中。将所有培养皿的细胞混合放入一个 15 ml 锥形试管。
    3. 细胞在 4°C 下以 1,000 x g 的离心力离心分离 5 分钟。去除 PBS 后继续进行步骤 4d。或者,细胞沉淀物可以放在干冰上冷冻,并保存在 -80°C 下供后续使用。
    4. 对于每份染色质制备物,在每 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中重悬最多 2 x 107 个细胞,并立即进行胞核制备和染色质碎裂(第三部分)。

III. 胞核制备和染色质碎裂

一次染色质制备量规定为 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个组织培养细胞。可以同时进行多份染色质制备,只要相应增加缓冲液用量并对 1 ml 样品进行超声处理。超声处理所使用的细胞数量和样品量对于产生合适大小的染色质片段非常关键。

在开始之前:

  • 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化。
  • 对于每份染色质制备物,配制 1 ml 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer(0.5 ml 2X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer #96529 + 0.5 ml 水)+ 5 µl 200X PIC。
  • 对于每份染色质制备物,配制 1 ml ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer #28778 + 5 µl 200X PIC。
  1. 将在第一部分或第二部分配制的 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中的细胞悬浮液放在冰上孵育 10 分钟。
  2. 在 4°C 下以 5,000 x g 的离心力让细胞沉淀 5 分钟。对于每份染色质制备物,去除上清液,然后在 1 ml 冰冷的 1X ChIP Sonication Cell Lysis Buffer + PIC 中再次重悬沉淀物。
  3. 细胞悬浮液放在冰上孵育 5 分钟。在 4°C 下以 5,000 x g 的离心力让细胞沉淀 5 分钟。请注意,超声处理之前,交联细胞可能并未完全裂解。
  4. 对于每份染色质制备物,在 1 ml 冰冷的 ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer #28778 + PIC 中重悬细胞,然后放在冰上孵育 10 分钟。将 1 ml 细胞悬浮液转移到大小合适的试管中进行超声处理。请注意,超声处理之前,交联细胞和胞核可能并未完全裂解。
  5. 通过超声处理碎片化染色质超声处理条件可能需要通过测试不同超声波仪功率设置和超声处理时长来凭经验确定。最佳超声处理条件可产生 60-90 % 小于 1kb 的染色质片段。较长的交联时间可能会使小于 1 kb 的片段比例降低至 30-60%,(见附件 B 中的图 7 和附件 C 中的图 8)。使用能产生所需染色质片段长度需要的最少超声处理循环次数,因为过度超声处理会因染色质苛刻处理而导致信号减弱或丢失。
    • 对于每份声处理样品,我们建议每 1 ml ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer 使用 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个细胞。对更多和/或更浓的细胞进行超声处理会降低染色质碎裂的效率。
    • 使用配有 1/8 英寸微探头的 Branson Digital Sonifier D250 探头超声波仪时,应用 8 分钟的 1 秒开/1 秒闭声处理周期(超声处理时间为 4 分钟)和 50% 振幅通常能产生良好的碎裂性能和染色质免疫沉淀效率。
    • 请确保在超声处理时以及各处理步骤之间将含有染色质的试管置于冰水槽中,以便让染色质样品在超声处理期间保持冷却。切勿让探头接触到试管底部或试管壁。如果染色质样品在超声处理期间起泡,则停止超声处理并调整试管位置。
  6. 在 4°C 下用微量离心机以 21,000 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。
  7. 将上清液转移至新试管。所得到的就是交联染色质制备物,可以立即用于进行免疫沉淀或保存在 -80°C 下供后续使用。取出 50 μl 染色质制备物进行染色质消化和浓度分析(第四部分)。

IV. 分析染色质碎裂和浓度(建议步骤)

  1. 向 50 μl 染色质样品(在第 三 部分的步骤 7 中制备)中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A#7013。涡旋混合,并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
  2. 向每份经 RNase A 消化的样品添加 2 μl Proteinase K #10012。涡旋混合并在 65℃ 下孵育样品 2 小时。
  3. 按第七部分中所述的步骤,使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA。
  4. DNA 纯化后,取 10 μl 样品并通过在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来确定 DNA 片段大小。DNA 拖尾预计为 200 bp 到几 kb(见附件 C 中的图 7)。大约 60-90% 的所有 DNA 片段应小于 1 kb。请参见附件 B 了解超声处理条件的优化。
  5. 使用分光光度计测量 DNA 浓度。在理想情况下,DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

五、染色质免疫沉淀法

为获得最佳 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用大约 5-10 μg 经超声处理的交联染色质(第 四 部分中确定的量)。这应大致相当于用 25 mg 离散组织或 4x106 个组织培养细胞制备的一份 100 µl 免疫沉淀制备物。在添加抗体之前,通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但如果每次免疫沉淀需要多于 100 µl 的染色质,则必须将交联染色质制备物按 1:4 的稀释比例在 1X ChIP 缓冲液中稀释。在这种情况下,无需添加 蛋白 G 磁珠,尽管延长用微珠孵育的时间比较有用。

在开始之前:

  • 取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。
  • 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008,确保 SDS 完全溶解。
  • 融化碎裂的染色质制备物(在第 三 部分的步骤 7 中制备)并放在冰上。
  • 配制低盐洗液:每次免疫沉淀配制 3 ml 1X ChIP Buffer(300 µl 10X ChIP Buffer #7008 + 2.7 ml 水)。置于冰上。
  • 配制高盐洗液:每次免疫沉淀配制 1 ml 1X ChIP Buffer(100 µl 10X ChIP Buffer #7008 + 900 µl 水)+ 70 µl 5M NaCl #7010。置于冰上。
  1. 在一根试管中,配制足够的 1X ChIP Buffer + PIC,用于将经超声处理的染色质稀释至能进行所需次数的免疫沉淀。对于每次免疫沉淀,染色质(5-10 µg DNA)用 1X ChIP Buffer + PIC 稀释至总量为 500 µl。要进行高效的免疫沉淀,必须以 1:4 或更高的稀释因数在 1 x ChIP buffer 中稀释染色质。将混合物置于冰上。确定免疫沉淀的次数时,记得计入阳性对照样品 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb#4620 和阴性对照样品 Normal Rabbit IgG antibody #2729
  2. 取出 10 μl 稀释的染色质样品并将其转移至微量离心管。这将作为 2% 样品输入对照,该样品在后续使用之前可以置于 -20℃ 下贮存(第六部分的步骤 1 )。
  3. 对于每次免疫沉淀,将 500 μl 稀释的染色质分装到 1.5 ml 微量离心管中,并加入免疫沉淀抗体。每次免疫沉淀所需的抗体用量有所不同,应按照制造商的建议使用。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb#4620,向免疫沉淀样品加入 10 μl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729,向免疫沉淀样品加入 1 µl (1 µg) 至 2 µl (2 µg)。免疫沉淀样品在 4℃ 下振荡孵育 4 小时至过夜。
  4. 注意:对于 Cell Signaling Technology 的多数抗体,每份免疫沉淀样品使用 1-2 µg 时的效果最佳。如有多份不同浓度的样品,最好让阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

  5. 轻轻涡旋来重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。每次免疫沉淀反应立即添加 30 µl Protein G Magnetic Beads,并在 4°C 下振荡孵育 2 小时。或者,微珠可以添加到步骤 3 中的过夜抗体孵育液中,但这可能会增强背景信号。
  6. 在每次免疫沉淀中,将试管放在磁分离架上让 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清,然后小心地移除上清液。
  7. Protein G Magnetic Beads 通过添加 1 ml 低盐洗液到微珠中进行洗涤,并在 4°C 下振荡孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次,以确保总共进行 3 次低盐洗涤。
  8. 向微珠中添加 1 ml 高盐洗液并且在 4℃ 下转动孵育 5 分钟。
  9. 在每次免疫沉淀中,将试管放在磁分离架上让 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清,然后小心地移除上清液。立即进入第六部分。

VI. 将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来并解交联

在开始之前:

  • 取 2X ChIP Elution Buffer #7009 放在 37°C 水浴槽中加热,并确保 SDS 溶解。
  • 将水浴或热混合仪设为 65℃。
  • 配制每次免疫沉淀所需的 150 µl 1X ChIP Elution Buffer(75 µl 2X ChIP Elution Buffer #7009 + 75 µl 水)和 2% 输入样品。
  1. 添加 150 µl 1X ChIP Elution Buffer 到 2% 输入样品试管中,并放在室温下直至进行步骤 7。
  2. 向每份 IP 样品中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液。
  3. 在 65°C 下,通过轻轻涡旋 (1,200 rpm) 将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来,持续 30 分钟。这个步骤最好使用恒温混匀仪,但在 65°C 水浴槽中频繁混合也可。或者,可以在室温下转动洗脱,但是可能不会完全洗脱。
  4. 样品以 10,000 x g 的离心力短暂离心分离 10 秒钟,以便去除微量离心管盖上的蒸发样品。
  5. 将试管放在磁分离架上让 Protein G Magnetic Beads 沉淀,并等待 1-2 分钟让溶液变澄清。
  6. 小心地将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管。
  7. 要解交联,向所有试管(包括步骤 1 中的 2% 输入样品)加入 6 µl 5M NaCl #7010 和 2 µl Proteinase K #10012,并在 65°C 下孵育 2 小时。这次孵育可以延长过夜。
  8. 立即进入第七部分。或者,样品可在 -20℃ 下贮存。但为了避免形成沉淀物,请确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前,将样品加热到室温(第 七 部分,步骤 1)。

VII. 使用离心柱纯化 DNA:

在开始之前:

  • 使用前添加 24 ml 乙醇 (96-100%) 到 DNA Wash Buffer #10008 中。此操作仅需在第一次DNA纯化前进行。
  • 为第 六 部分的每份 DNA 样品准备一根 DNA 纯化离心柱和收集管 #10010
  1. 添加 750 µl DNA Binding Buffer #10007 到每份 DNA 样品中,涡旋片刻。
    • 对于每 1 体积样品,应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。
  2. 对于步骤 1 中的每份 DNA 样品,转移450 μl 到收集管中的 DNA 离心柱上。
  3. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
  4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  5. 对于步骤 1 中的每份 DNA 样品,转移剩余的 450 μl 到收集管中的离心柱上。重复步骤 3 和 4。
  6. 添加 750 µl DNA Wash Buffer #10008 到收集管中的离心柱上。
  7. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
  8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  9. 用微量离心机以 14,000 rpm 的转速离心分离 30 秒钟。
  10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
  11. 添加 50 μl DNA Elution Buffer #10009 到每根离心柱上,并放在 1.5 ml 干净的微量离心管中。
  12. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒,以洗脱 DNA。
  13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。样品可在 -20℃ 下贮存。

八、通过 PCR 定量 DNA:

建议:

  • 使用过滤式吸液头来尽量减少污染风险。
  • 该试剂盒中的对照引物对人或小鼠 RPL30 基因(#7014#7015)具有特异性,可用于标准 PCR 或定量实时 PCR。如果用户对其他物种进行 ChIP,建议用户设计针对 DNA 的相应引物,并确定最佳 PCR 条件。
  • 建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。
  • PCR 引物选择至关重要。应当严格遵循以下标准设计引物:
    引物长度: 24 个核苷酸
    最佳 Tm: 60℃
    最佳 GC: 50%
    扩增子尺寸: 150 至 200 bp(标准 PCR)
    80 至 160 bp(实时荧光定量 PCR)

标准 PCR 方法:

  1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。这些样品应当包括 2% 样品输入对照、阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品,和未加入 DNA 的试管以排除 DNA 污染。
  2. 向每支管中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物,配置时多配置两个样本的试剂以弥补分管时的体积损耗。向每支反应管中添加 18 μl 主混合物。
    试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
    无核酸酶的 H2O 12.5 μl
    10X PCR 缓冲液 2.0 μl
    4mM dNTP 混合物 1.0 μl
    5 μM RPL30 引物 2.0 μl
    Taq DNA 聚合酶 0.5 μl
  4. 启动以下 PCR 反应程序:
    1. 初始变性:在 95°C 下进行 5 分钟
    2. 变性:在 95°C 下进行 30 秒钟
    3. 退火:在 62°C 下进行 30 秒钟
    4. 延伸:在 72°C 下进行 30 秒钟
    5. 重复步骤 b-d,共循环 34 次。
    6. 最终延伸:在 72°C 下进行5 分钟
  5. 从每支反应管中取出 10 μl PCR 产物,使其与 100 bp DNA 标准品同时进行 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳,以进行分析。人 RPL30 #7014 和小鼠 RPL30 #7015 的 PCR 产物的预期大小分别是 161 bp 和 159 bp。

实时荧光定量 PCR 方法:

  1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应当包括阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的试管和 2% 输入对照组染色质 DNA 的连续稀释物(未稀释、1:5、1:25、1:125),以生成标准曲线并测定扩增效率。
  2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。每次 PCR 反应设置 2-3 次复制。添加足够试剂来补充容积损失。向每支 PCR 反应管或每个孔中添加 18 μl 反应混合物。1 次 PCR 反应的试剂量 (18 μl)
    无核酸酶的 H2O 6 μl
    5 μM RPL30 引物 2 μl
    SYBR-Green Reaction Mix 10 μl
  4. 启动以下 PCR 反应程序:
    a. 初始变性 95℃ 3 分钟
    b. 变性 95℃ 15 秒
    c. 复性和延伸: 60℃ 60 秒
    d. 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。
  5. 使用实时 PCR 仪的自带软件,分析定量 PCR 结果。或者,可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式,手动计算 IP 效率。采用这种方法,从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。

    输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样品 - C[T] 免疫沉淀样品)
    C[T] = CT = PCR 反应的平均循环阈值

九、NG-Sequencing文库构建

用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库,请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。要在 Illumina® 平台上测序,我们建议使用 NEBNext® Ultra™ II Library Prep Kit for Illumina®(New England Biolabs;货号:E7645S/L)。

建议:

  • 对于转录因子或辅因子 ChIP-seq,使用至少 5 ng ChIP 富集的 DNA 和 10 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
  • 对于总组蛋白和组蛋白修饰或样品输入对照,开始时使用至少 50ng ChIP 富集的 DNA 和 6 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
  • 要对全部靶标类型的 ChIP-富集的 DNA 构建文库,需对衔接子连接的 DNA 进行纯化,但无需进行大小选择。
  • 在构建 DNA 文库之后,使用 Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies,货号:G2938-90322)或通过与 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳,来检验 DNA 文库中衔接子二聚体(约 140 bp)是否存在。如果有接头蛋白二聚体,则重复清除 PCR 扩增物质。
  • 也可通过对已知阳性和阴性靶基因座使用 qPCR 和引物组来确认文库的质量。与阴性引物相比,阳性引物对仍然应当产生相同的高信号,如原始 qPCR 分析 ChIP 富集的 DNA 时所见。
  • 完成最终的纯化和质量检验后,制备浓度为 2-10 nM 的最终纯化文库样品以用于高通量测序。

附件 A:预期的染色质产量

从组织样品收获交联的染色质时,组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表提供用 100 mg 组织与 2 x 107 个 HCT 116 细胞制备的染色质的预期产量范围,以及实验步骤第 四 部分确定的预期 DNA 浓度。为获得最佳 ChIP 结果,我们建议每次免疫沉淀使用 5-10 μg 经超声处理的交联染色质。

组织/细胞 染色质总产率 预期 DNA 浓度
每 100 mg 组织使用 50 µg 150 µg/ml
每 100 mg 组织使用 25 µg 50 µg/ml
心脏 每 100 mg 组织使用 105 µg 20 µg/ml
HCT 116 100-150 μg/2 x 107 个细胞 100-150 μg/ml

附件 B:甲醛固定的优化

转录因子和辅因子结合染色质 DNA 没有结合组蛋白紧密。因此,它们在超声处理期间容易脱离染色质。在 ChIP 实验中,延长固定时间能捕获更多转录因子和辅因子,尤其是使用组织样品时。如图 7 所示,固定时间从 10 分钟延长至 30 分钟可能会减小染色质片段(左小图),但 ChIP-qPCR 表明,这会显著增加心脏组织中辅因子 RING1B 和 SUZ12 的富集(中间小图和右小图)。

通常,对于同时使用细胞和组织样品的组蛋白修饰 ChIP,10 分钟固定即可,而转录因子和辅因子可能需要长达 30 分钟的额外固定时间,尤其是使用组织样品时。

FIGURE 7. Mouse heart (H), brain (B), and liver (L) were cross-linked for 10 min or 30 min, as indicated (left panel). The chromatin was prepared and sonicated, DNA was purified and 20 µl was separated by electrophoresis on a 1% agarose gel. In the ChIP-qPCR assay (middle and right panels), chromatin immunoprecipitations were performed with either 10 µl of RING1B (D22F2) XP<sup>®</sup> Rabbit mAb #5694 or 5 µl of SUZ12 (D39F6) XP<sup>®</sup> Rabbit mAb #3737. The enriched DNA was quantified by real-time PCR using SimpleChIP<sup>®</sup> Mouse HoxD10 Exon 1 Primers #7429, SimpleChIP<sup>®</sup> Mouse HoxA1 Promoter Primers #7341, and SimpleChIP<sup>®</sup> Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986. The amount of immunoprecipitated DNA in each sample is represented as normalized signal to the negative GAPDH locus (equivalent to one).

图 7. 使小鼠心脏 (H)、脑 (B) 和肝 (L) 细胞交联 10 分钟或 30 分钟,如图所示(左小图)。染色质制备后进行超声处理,DNA 进行纯化并通过对 1% 琼脂糖凝胶进行电泳来分离 20 µl。在 ChIP-qPCR 检测(中间小图和右小图)中,使用 10 µl RING1B (D22F2) XP® Rabbit mAb #5694 或 5 µl SUZ12 (D39F6) XP® Rabbit mAb #3737 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Mouse HoxD10 Exon 1 Primers #7429、SimpleChIP® Mouse HoxA1 Promoter Primers #7341 和 SimpleChIP® Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为向阴性 GAPDH 基因座发出的标准化信号(等于 1)。

附件 C:染色质碎裂的优化

交联染色质 DNA 碎裂的最佳条件高度依赖于使用的细胞数量、样品体积、超声处理时长和超声波仪功率设置。对于每份声处理样品,我们建议每 1 ml ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer 使用 100-150 mg 组织或 1 x 107 - 2 x 107 个细胞。 以下是确定某种特定组织或细胞类型的最佳超声处理条件的实验步骤。

  1. 按照第 一、二 和 三 部分的说明,用 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个细胞制备交联胞核。在第三部分的步骤 4 之后停止,并如下所述继续。
  2. 通过超声处理碎片化染色质对于指定超声波仪,可以通过在规定功率设置(参见第 三 部分的步骤 5,以了解使用 Branson Digital Sonifier 250 探头超声波仪的最佳功率设置)下改变超声处理循环次数或时长来确定最佳超声处理条件。要确定最佳超声处理条件,设计一项超声处理时程实验,并在某个超声处理循环或时长后取出 50 µl 染色质样品。例如,每 1-2 分钟超声处理后取出染色质样品。
  3. 在 4°C 下用微量离心机以 21,000 x g 的离心力离心分离 10 分钟,以让染色质样品变澄清。
  4. 将上清液转移到新微量离心管中,并加入 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合,并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
  5. 向每份经 RNase A 消化的样品添加 2 μl Proteinase K #10012。涡旋混合并在 65℃ 下孵育样品 2 小时。
  6. 从每份样品中取 20 µl,并确定 DNA 片段大小。
  7. 选择能产生最佳 DNA 片段大小的超声处理条件,并用于第 三 部分步骤 5 中的染色质制备。如果未达到最佳超声处理条件,则增加或减少超声波仪的功率设置,并重复超声处理时程。

注意:使用不同样品类型和固定时间时,最佳超声处理条件也不同。使用产生所需长度染色质片段需要的最少超声处理循环次数。超过 80% 短于 500 bp 的总 DNA 片段表明,过分超声处理会导致染色质过度受损,并会降低免疫沉淀效率(见图 8,右小图)

  • 对固定 10 分钟的细胞进行超声处理时,最佳超声处理条件会产生 DNA 拖尾,其中含有约 90% 短于 1 kb 的 DNA 总片段(见图 8,左小图)。延长固定时间至 30 分钟会限制碎裂过程,从而产生 DNA 拖尾,其中含有约 60% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。
  • 对固定 10 分钟的组织进行超声处理时,最佳超声处理条件会产生 DNA 拖尾,其中含有约 60% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。延长固定时间至 30 分钟会限制碎裂过程,从而产生 DNA 拖尾,其中含有约 30% 短于 1 kb 的 DNA 总片段(见图 7,左小图)。
FIGURE 8. Chromatin immunoprecipitations were performed with 2 x 10<sup>7</sup> HCT 116 cells that were cross-linked for 10 min and sonicated for the time indicated (left panel). DNA was purified as described in Section IV of the SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383, and 20 µl of purified DNA was separated by electrophoresis on a 1% agarose gel. As shown in the left panel, increasing cycles of sonication reduces the size of chromatin fragments. Chromatin immunoprecipitations were performed with either 5 µl of Non-phospho (Active) Β-Catenin (Ser33/37/Thr41) (D13A1) Rabbit mAb #8814, 10 µl of TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569, or 2 µl of Normal Rabbit IgG #2729 using SimpleChIP<sup>®</sup> Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383. The enriched DNA was quantified by real-time PCR using SimpleChIP<sup>®</sup> Human CaMK2D Intron 3 Primers #5111 and SimpleChIP<sup>®</sup> Human α Satellite Repeat Primers #4486. The amount of immunoprecipitated DNA in each sample is represented as signal relative to the total amount of input chromatin (equivalent to one; right panel). As shown, 4 min of chromatin sonication is optimal when using a Branson Digital Sonifier D250 probe sonicator with a 1/8 inch Micro Tip. Over-sonication significantly impairs enrichment of both cofactor beta-catenin and transcription factor TCF4/TCF7L2 containing chromatin.

图 8. 对交联 10 分钟并经超声处理规定时长的 2 x 107 个 HCT 116 细胞进行染色质免疫沉淀(左小图)。DNA 按照 SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383 的第 四 部分的说明进行纯化,并在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来分离 20 µl 纯化 DNA。如左小图所示,增加超声处理循环次数会减小染色质片段的大小。使用 SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383 对 5 µl Non-phospho (Active) Β-Catenin (Ser33/37/Thr41) (D13A1) Rabbit mAb #8814、10 µl TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 或 2 µl Normal Rabbit IgG #2729 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Human CaMK2D Intron 3 Primers #5111 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为与输入染色质的总量(等于 1;右小图)相对应的信号。如图所示,使用配有 1/8 英寸微探头的 Branson Digital Sonifier D250 探头超声波仪时,4 分钟的染色质声处理最佳。过度超声处理会明显有损辅因子 β-catenin 和包含染色质的转录因子 TCF4/TCF7L2 的富集。

附件 D:疑难排除指南

将交联时间缩短到 10-30 分钟的范围。减少每次超声处理的细胞/组织数量。进行超声处理时程。
问题 可能的原因 建议
1. 碎裂染色质的浓度过低。

细胞/细胞核裂解不完全。

染色质制备没有使用足够细胞。

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml,则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg,然后继续实验。

交联前,对单独平板上的细胞进行计数,以确定准确的细胞数量。

2. 染色质碎裂不足,且片段过大(超过 50% 的片段大于 1.5 kb)。

细胞可能已经过度交联。

处理了过多细胞/组织。

将交联时间缩短到 10-30 分钟的范围。减少每次超声处理的细胞/组织数量。进行超声处理时程。

3. 染色质过度碎裂(超过 90% 的片段小于 300 bp)。

超声处理条件太苛刻。

进行一次超声处理时程来找到进行相应超声处理的最小输出/时长。

4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。

加入到免疫沉淀的染色质不足,或染色质被过度超声处理。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

使用从交联并经超声处理的染色质中获得的纯化 DNA 来优化针对实验用引物组的 PCR 条件。为获得最佳 ChIP 结果,每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。

5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。

添加至 IP 反应的染色质或抗体不足,或者 IP 孵育时间过短。

蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。

确保每次免疫沉淀反应添加 5-10 µg 染色质和 10 µl 抗体,并用抗体孵育过夜,添加蛋白 G 微珠之后再孵育 2 小时。

在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳,同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。

6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。

添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者,添加至 IP 反应的抗体过多。

添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。

向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。每次 IP 将 Normal Rabbit IgG 缩减至1 µl/IP。

向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则,起始 DNA 数量的差异无法准确测量。

7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足。

添加至 IP 反应的抗体不足。

抗体不适用于 IP。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

通常,免疫沉淀反应需添加 1-5 µg 抗体;但准确的用量在很大程度上取决于具体抗体。

增加添加至 IP 反应的抗体量。寻找其他替代抗体。

发布​于 2017 年 3 月 

实验步骤编号:1404

特异性/敏感性

仅在 Stat3的酪氨酸 705 位点被磷酸化时,Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb 方可检测内源水平的 Stat3 。该抗体不会与磷酸-EGFR 或其他 Stat 蛋白的相应磷酸酪氨酸发生交叉反应。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

仓鼠 , 牛 , 猪 , 马

来源/纯化

使用与小鼠 Stat3 中 Tyr705 周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Stat3 转录因子是众多细胞因子和生长因子受体的重要信号转导 (1),对胎鼠发育必不可少 (2)。研究显示 Stat3 在多种人类肿瘤中持续激活 (3,4) ,并有致癌的潜在可能性 (5),具有抗凋亡活性 (3)。Stat3 通过 Tyr705 位点的磷酸化而激活,从而诱导二聚化、核转位、DNA 结合 (6,7)。转录激活似乎受到 MAPK 或 mTOR 通路介导的 Ser727 位点磷酸化的调控 (8,9)。Stat3 同工型的表达反应了生物学功能,Stat3α (86 kDa) 和 Stat3β (79 kDa) 相对表达水平,依赖于细胞类型、配体暴露或者细胞发育的成熟阶段 (10) 。值得注意的是,Stat3β 蛋白在羧基末端转录激活结构域缺少丝氨酸磷酸化位点 (8)。

  1. Heim, M.H. (2001) J Recept Signal Transduct Res 19, 75-120.
  2. Takeda, K. et al. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94, 3801-4.
  3. Catlett-Falcone, R. et al. (1999) Immunity 10, 105-15.
  4. Garcia, R. and Jove, R. (1998) J Biomed Sci 5, 79-85.
  5. Bromberg, J.F. et al. (1999) Cell 98, 295-303.
  6. Darnell, J.E. et al. (1994) Science 264, 1415-21.
  7. Ihle, J.N. (1995) Nature 377, 591-4.
  8. Wen, Z. et al. (1995) Cell 82, 241-50.
  9. Yokogami, K. et al. (2000) Curr Biol 10, 47-50.
  10. Biethahn, S. et al. (1999) Exp Hematol 27, 885-94.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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