免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

1. 二甲苯
2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）
3. 去离子水 (dH₂O)
4. Hematoxylin（可选）
5. 洗涤缓冲液：
   1. 1X Tris Buffered Saline with Tween^® 20 (TBST)：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^® 的 2010 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH ₂0，然后进行搅拌。
6. Antibody Diluent PBST/5% normal goat serum (#5425): 在 5 ml 1X PBST 中，加入 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   1. 1X PBST：To prepare 1X PBST, add 50 ml Phosphate Buffered Saline with Tween^® 20 (PBST-20X) (#9809) to 950 ml dH₂O, mix.
7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 ml 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 用 225 ml 的 dH₂O 进行稀释。
8. 3% 过氧化氢： 要制备，添加 10 ml 30% H₂O₂ 到 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：向 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：向 4 mL dH₂O 中添加 1 ml Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
10. 检测系统： VECTASTAIN^® Elite ABC, including biotinylated secondary antibody (Vector Laboratories).
11. 基质：Vector^® NovaRED™ (Vector Laboratories).
12. Hematoxylin（苏木精）‭： Hematoxylin(#14166)。
13. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#84583)。

B. 脱蜡/复水

注：务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：把切片浸入 1X 柠檬酸盐修复液中后放入微波炉中加热，直至开始沸腾；随后使之在亚沸温度 (95°-98°C) 下保持 10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液，在室温下封闭 1 小时。
6. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。4°C 温度下孵育过夜。
7. 根据制造商建议说明制备 ABC 溶液。
8. 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗（根据制造商建议在 TBST 中进行稀释）。在室温孵育 30 分钟。
9. 清除二抗溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 按需使用100-400µl 预混合 ABC 溶液覆盖切片，并在湿盒中室温孵育30分钟。
11. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
12. 根据制造商建议说明制备 Vector^® NovaRED™。
13. 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察，通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。