Western Blotting Application Solutions Kit #12957

12957 Western Blotting Application Solutions Kit 实验步骤

重要提示：请参阅一抗数据表或产品网页以了解建议的一抗稀释缓冲液和建议的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

提供的试剂

1. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液：将 1 ml 10X 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O。将缓冲液放在冰上预冷，并在使用前立即添加 50 µl 200X PMSF。
2. 200X PMSF：(#8553) 在 1 ml 异丙醇中重新配制 34.84 mg 冻干的 PMSF，制成 200 mM 溶液。
3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Buffer Pack (#7722)。通过添加 1/10 体积的 30X DTT (#14265) 到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液 (#56036) 中，以制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液。用 dH₂O 将其稀释至 1X。
4. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
5. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH₂O 中并混合。
6. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中，并混合。
7. Nitrocellulose Sandwiches: (#12369)。
8. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10X Tris 缓冲盐水：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。
9. 脱脂奶粉：(#9999)。
10. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
11. 洗涤缓冲液：1X TBST。
12. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
13. 一抗稀释缓冲液：如一抗数据表上所示，含 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉并充分混匀。
14. 与 HRP 偶联的二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。
15. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。试剂 A (#46935) 和 B (#74709) 应该在使用前合并。

其他试剂（未提供）

1. 一抗。
2. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 并混合。
3. 反渗透去离子（RODI）水。
4. 异丙醇。
5. BCA Protein Assay Kit：(#7780)（可选）。
6. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)（可选）。
7. 甲醇。
8. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH₂O 并混合。（可选）。
9. Streptavidin-HRP：(#3999)（如需要）。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。如果进行蛋白质浓度定量，请继续执行步骤 #3，否则，请跳至步骤 #8。
3. 加入 1X 细胞裂解缓冲液（6 孔板每孔 80 µl 或 10 cm 直径的反应板 400 µl）来裂解细胞。在冰上孵育反应板 5 分钟，然后从反应板上刮下细胞，然后将裂解液转移到微量离心管中。置于冰上。
4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。置于冰上。
5. 提取物用冷微量离心机以 14,000 x g 速率分离 10 分钟。将上清液转移到新管中并丢弃沉淀物。
6. 使用 BCA Protein Assay Kit #7780 测定蛋白浓度。
7. 加入 3X SDS 样品缓冲液至终浓度 1X。继续进行步骤 #10。
8. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的反应板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
9. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。置于冰上。
10. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
11. 微量离心机内离心 5 分钟。
12. 使用 1X 电泳缓冲液来制备电泳凝胶和仪器。
13. 上样 15 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，5 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#81851，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

14. 在水箱（湿式）转膜系统中使用 1X 转膜缓冲液用电转至硝酸纤维素膜（#12369）。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜或更小的膜；对于更大的膜，可相应调整容量。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

根据所使用的一抗，继续下述其中一项的具体步骤。

对于无偶联的一抗

1. 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 按一抗来源选取合适的 HRP 偶联的二抗（#7074 或 #7076，按 1:2000），而且在必要时加入 anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075 ，按 1: 1000-1:3000）以检测生物素化的蛋白质标准品，置于 10 ml 封闭缓冲液中在室温下孵育 1 小时并不时轻轻搅动。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

对于偶联有HRP 的一抗

1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 如有必要，与检测生物素酰化蛋白质标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075 ，按 1: 1000-1:3000）在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中一起孵育 1 小时并不时轻轻搅动。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

对于生物素化的一抗

1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 在10 ml 封闭缓冲液中使用 1:2000 Streptavidin-HRP（#3999，未提供）孵育膜，在室温条件下轻轻摇动 1 小时。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

请勿加入用于检测生物素化蛋白标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标准品可视化。

D. 蛋白质检测

1. 在 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂A (#46935)、5 ml 试剂 B (#74709)）中孵育膜，在室温条件下轻轻摇动 1 分钟。
2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

   注：由于检测反应的动力学，孵育后信号最强烈。