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7780
BCA Protein Assay Kit
WB & IP 试剂
检测系统试剂盒

BCA Protein Assay Kit #7780

引用 (0)
BCA Protein Assay Kit: 图像 1

通过使用 Cell Lysis Buffer #9803、RIPA Buffer #9806 和 PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer #7018,对 125 至 2,000 μg/ml 的牛血清白蛋白 (BSA) 生成标准曲线。

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7780S
1 个试剂盒(960 次检测)

产品包括 数量
BCA Protein Assay Reagent A 250 ml
BCA Protein Assay Reagent B 25 ml
BCA Protein Assay Albumin Standard 10 单位
Compatibility Reagent 48 ea
Reconstitution Buffer 15 ml

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室温保存。

实验步骤

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BCA 蛋白检测方案

重要信息:当均于 1X 使用时,此 BCA Protein Assay Kit 兼容,已经过全面测试并批准与 Cell Lysis Buffer (10X) #9803、RIPA Buffer (10X) #9806 和 PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018一起使用。尚未在任何其他缓冲液上评估此测定的兼容性。

A. 溶液和试剂

试剂盒内容:

  • BCA 试剂 A: 250 ml(0.1 M 氢氧化钠中碳酸钠、碳酸氢钠、二喹啉甲酸以及酒石酸钠溶液)。
  • BCA 试剂 B: 25 ml(4% 硫酸铜)。
  • 兼容性试剂:9.3 mg × 48 微管。
  • 复溶缓冲液:15 ml。
  • 白蛋白标准品 (2 mg/ml): 10 × 1 ml 安瓿瓶的 0.9% NaCl 和 0.05% 叠氮化钠溶液中牛血清白蛋白 (BSA)。

需要附加材料:

  • 96 孔板与吸光度测量酶标仪兼容(例如 Costar #3797
  • 可调体积移液器和一次性移液器吸头
  • 温度为 37 ºC 的培养箱
  • 酶标仪能够测量在 562 nm 的吸光度

B. 标准品制备

使用与未知样品相同的缓冲液将一个白蛋白标准品 (BSA) 安瓿瓶的内容物稀释成几个微量离心管。使用下表作为指导以制备一组标准品(测定范围= 125-2,000 ug/ml)。

药瓶 稀释剂/样品缓冲液体积 (µl) BSA 来源和体积 (µl) 浓度 (µg/ml)
A 0 200 贮备液 2,000
B 66 200 贮备液 1,500
C 100 100 瓶 A 1,000
D 100 100 瓶 B 750
E 100 100 瓶 C 500
F 100 100 瓶 E 250

注意:请勿丢弃任何未使用的、未稀释的 BSA 标准品 (2 mg/ml)。BSA 标准品可储存在 4 °C 微量离心管中,最长可达 2 周。切勿冷冻。

C. 试剂配制

工作复溶缓冲液:

用 dH2O 以 1:1 稀释复溶缓冲液。如果蛋白质样品的 pH <6.0 或含有 EDTA 或咪唑,则不要稀释复溶缓冲液。

兼容性试剂溶液:

使用干净的移液器吸头穿刺覆盖在兼容性试剂管上的箔。添加 100 µl 工作复溶缓冲液进入试管中,通过搅拌试管底部和上下吹打 15-20 次来溶解。将此溶液于 4°C 避光储存 8 小时。可以将用过的微管切下并从未使用的微管中丢弃。将未使用的微管放回装有干燥剂包的小袋中。

注意:每个测定的样品需要 4 µl 兼容性试剂溶液。

BCA 工作试剂 (WR):

使用以下公式确定所需的 WR 总量:

(# 对照 + # 标准品 + # 未知样品)×(# 次重复样品)×(每个样品的 WR 体积)= 需要的 WR 总体积。

示例:三个未知样品和每个样品的两个重复样品:

(2 对照 + 7 标准品 + 3 未知物)× (2 重复样品)× (0.26 ml) = 6.24 需要 ml WR。

为制备 WR,混合 50 部分的 BCA 试剂 A 与 1 部分的 BCA 试剂 B(50:1,试剂 A:B)。6.24 ml WR = 6.12 ml 试剂 A + 0.12 ml 试剂 B

注意:当试剂 B 添加到试剂 A 时,溶液出现浑浊但混合时产生澄清的绿色 WR。

D. 测定

注意:精切移液至关重要。获得最佳结果,使用 1-10 µl 移液器。完全排出尖端的任何液体。移液时的小误差会导致测量吸光度时的大误差。

将样品直接添加到孔的中心,并避免接触孔的侧面。

在同一组样品中可以使用相同的吸头。添加兼容试剂溶液时,为每个样品使用不同的移液器。

如果蛋白质样品的 pH <5.0,则用复溶缓冲液以 1:1 稀释样品。

  1. 将 9 µl 标准对照、样品对照、蛋白质标准品或未知样品添加到微孔板上的各个孔。
  2. 将 4 µl 兼容性试剂溶液添加至每个孔的样品中。
  3. 盖板,并在平板振荡器上混合 1 分钟,然后在 37°C 孵育 15 min。
  4. 每个孔添加 260 µl WR。盖板并在平板振荡器上混合 1 min。如果样品含有洗涤剂,混合后盖板。37°C 条件下孵育平板 30 min。
  5. 室温冷却板 (RT) 5 min。
  6. 使用标准对照作为空白。于562 nm 在酶标仪上测量标准品、未知样品以及样品对照。

E. 数据分析

因为 BCA 测定未达到真正的终点,即使冷却到 RT,仍将继续显色。RT 下吸光度以每分钟 ~0.25% 速率增加。

  1. 从所有未知样品的重复样品吸光度值562 nm 中减去样品对照重复样品的平均吸光度值 562 nm。
  2. 通过绘制每种 BSA 标准品的空白校正平均562 nm 值与其浓度 (µg/ml) 的关系来绘制标准曲线。使用标准曲线确定每个未知样品的蛋白质浓度。

    注意:如果使用与酶标仪相关的曲线拟合算法,四参数(二次)曲线产生比线性曲线更准确的拟合。

发布​于 2020 年 6 月 

实验步骤编号:2104

产品说明

BCA Protein Assay Kit 可用于检测微孔板上用以下缓冲液制备的裂解物或匀浆蛋白浓度:Cell Lysis Buffer (10X) #9803、RIPA Buffer (10X) #9806、PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018。该测定法的动态范围为 0.125 - 2 mg/mL。建议使用 BCA Compatibility Reagent 减少还原剂、螯合剂、去垢剂以及多数裂解缓冲液中的其他常见组分所引起的干扰。请参阅随附实验步骤了解其他详细信息。

背景

二辛可宁酸 (BCA) 在碱性环境下能与亚铜离子 (Cu1+) 形成一种深紫色复合体。蛋白与碱性 Cu2+ 发生反应会产生 Cu1h+。由此产生的反应和颜色是能够检测各种蛋白浓度的常见蛋白定量方法的基础。蛋白浓度升高会使颜色按比例加深。与 Lowry 技术相比,BCA 蛋白测定法对常见干扰物质(如非离子去垢剂和缓冲盐)具有更高的抗干扰度 (1)。

  1. Smith, P.K. et al. (1985) Anal Biochem 150, 76-85.

限制使用

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