BCA Protein Assay Kit #7780

BCA 蛋白检测方案

重要信息：当均于 1X 使用时，此 BCA Protein Assay Kit 兼容，已经过全面测试并批准与 Cell Lysis Buffer (10X) #9803、RIPA Buffer (10X) #9806 和 PathScan^® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018一起使用。尚未在任何其他缓冲液上评估此测定的兼容性。

A. 溶液与试剂

试剂盒内容：

• BCA 试剂 A： 250 ml（0.1 M 氢氧化钠中碳酸钠、碳酸氢钠、二喹啉甲酸以及酒石酸钠溶液）。
• BCA 试剂 B： 25 ml（4% 硫酸铜）。
• 兼容性试剂：9.3 mg × 48 微管。
• 复溶缓冲液：15 ml。
• 白蛋白标准品 (2 mg/ml)： 10 × 1 ml 安瓿瓶的 0.9% NaCl 和 0.05% 叠氮化钠溶液中牛血清白蛋白 (BSA)。

需要附加材料：

• 96 孔板与吸光度测量酶标仪兼容（例如 Costar #3797）
• 可调体积移液器和一次性移液器吸头
• 温度为 37 ºC 的培养箱
• 酶标仪能够测量在 562 nm 的吸光度

B. 标准品制备

使用与未知样品相同的缓冲液将一个白蛋白标准品 (BSA) 安瓿瓶的内容物稀释成几个微量离心管。使用下表作为指导以制备一组标准品（测定范围= 125-2,000 ug/ml）。

注意：请勿丢弃任何未使用的、未稀释的 BSA 标准品 (2 mg/ml)。BSA 标准品可储存在 4 °C 微量离心管中，最长可达 2 周。切勿冷冻。

C. 试剂配制

工作复溶缓冲液：

用 dH₂O 以 1:1 稀释复溶缓冲液。如果蛋白质样品的 pH <6.0 或含有 EDTA 或咪唑，则不要稀释复溶缓冲液。

兼容性试剂溶液：

使用干净的移液器吸头穿刺覆盖在兼容性试剂管上的箔。添加 100 µl 工作复溶缓冲液进入试管中，通过搅拌试管底部和上下吹打 15-20 次来溶解。将此溶液于 4°C 避光储存 8 小时。可以将用过的微管切下并从未使用的微管中丢弃。将未使用的微管放回装有干燥剂包的小袋中。

注意：每个测定的样品需要 4 µl 兼容性试剂溶液。

BCA 工作试剂 (WR)：

使用以下公式确定所需的 WR 总量：

（# 对照 + # 标准品 + # 未知样品）×（# 次重复样品）×（每个样品的 WR 体积）= 需要的 WR 总体积。

示例：三个未知样品和每个样品的两个重复样品：

（2 对照 + 7 标准品 + 3 未知物）× （2 重复样品）× (0.26 ml) = 6.24 需要 ml WR。

为制备 WR，混合 50 部分的 BCA 试剂 A 与 1 部分的 BCA 试剂 B（50:1，试剂 A:B）。6.24 ml WR = 6.12 ml 试剂 A + 0.12 ml 试剂 B

注意：当试剂 B 添加到试剂 A 时，溶液出现浑浊但混合时产生澄清的绿色 WR。

D. 测定

注意：精切移液至关重要。获得最佳结果，使用 1-10 µl 移液器。完全排出尖端的任何液体。移液时的小误差会导致测量吸光度时的大误差。

将样品直接添加到孔的中心，并避免接触孔的侧面。

在同一组样品中可以使用相同的吸头。添加兼容试剂溶液时，为每个样品使用不同的移液器。

如果蛋白质样品的 pH <5.0，则用复溶缓冲液以 1:1 稀释样品。

1. 将 9 µl 标准对照、样品对照、蛋白质标准品或未知样品添加到微孔板上的各个孔。
2. 将 4 µl 兼容性试剂溶液添加至每个孔的样品中。
3. 盖板，并在平板振荡器上混合 1 分钟，然后在 37°C 孵育 15 min。
4. 每个孔添加 260 µl WR。盖板并在平板振荡器上混合 1 min。如果样品含有洗涤剂，混合后盖板。37°C 条件下孵育平板 30 min。
5. 室温冷却板 (RT) 5 min。
6. 使用标准对照作为空白。于562 nm 在酶标仪上测量标准品、未知样品以及样品对照。

E. 数据分析

因为 BCA 测定未达到真正的终点，即使冷却到 RT，仍将继续显色。RT 下吸光度以每分钟 ~0.25% 速率增加。

1. 从所有未知样品的重复样品吸光度值562 nm 中减去样品对照重复样品的平均吸光度值 562 nm。
2. 通过绘制每种 BSA 标准品的空白校正平均562 nm 值与其浓度 (µg/ml) 的关系来绘制标准曲线。使用标准曲线确定每个未知样品的蛋白质浓度。

   注意：如果使用与酶标仪相关的曲线拟合算法，四参数（二次）曲线产生比线性曲线更准确的拟合。