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91044
CD68 (D4B9C) & CO-0007-750 SignalStar™ Oligo-Antibody Pair
SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂
寡核苷酸抗体对

CD68 (D4B9C) & CO-0007-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #91044

筛选器:
  1. IHC
使用 CD68 (D4B9C) & CO-0007-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #83113(红色)、HER2/ErbB2 (D8F12) & CO-0019-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #31149(绿色)、Granzyme B (D6E9W) & CO-0009-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #84484(洋红色)、α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) & CO-0024-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #25040(黄色)、CD45 (Intracellular Domain) (D9M8I) & CO-0013-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #15734(橙色)、CD8α (D8A8Y) & CO-0004-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #62750(青色)、CD31 (PECAM-1) (89C2) & CO-0028-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #58365(白色)和 ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961(蓝色),对石蜡包埋的人乳腺浸润性导管癌组织进行 SignalStar 多重免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩,如图所示。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 上进行染色。
使用 CD68 (D4B9C) & CO-0007-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #73071(绿色)对石蜡包埋的人非小细胞肺癌组织进行 SignalStar 免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩,如图所示。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 上进行染色。
使用 CD68 (D4B9C) & CO-0007-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #77318(黄色)对石蜡包埋的人胃腺癌组织进行 SignalStar 免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩,如图所示。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 上进行染色。
使用 CD68 (D4B9C) & CO-0007-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #83113(红色)对石蜡包埋的人非小细胞肺癌组织进行 SignalStar 免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩,如图所示。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 上进行染色。
使用 CD68 (D4B9C) & CO-0007-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #91044(青色)对石蜡包埋的人胃腺癌组织进行 SignalStar 免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩,如图所示。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 上进行染色。
与使用 CD68 (D4B9C) XP® Rabbit mAb #76437(右图)对石蜡包埋的人非小细胞肺癌组织的序列切片进行的显色免疫组织化学分析相比较,使用 CD68 (D4B9C) & CO-0007-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #91044(左图,白色)和 ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961(左图,蓝色)对石蜡包埋的人非小细胞肺癌组织进行 SignalStar 多重免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩,如图所示。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 上进行染色。
使用 CD68 (D4B9C) & CO-0007-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #77318(黄色)、CD31 (PECAM-1) (89C2) & CO-0028-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #83823(绿色)、Pan-Keratin (C11) & CO-0003-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #16373(红色)和 α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) & CO-0024-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #29280(青色)对石蜡包埋的人胃腺癌组织进行 SignalStar 多重免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩,如图所示。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 上进行染色。
使用 CD68 (D4B9C) & CO-0007-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #91044(青色)和 PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #28249(黄色)对石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌组织进行 SignalStar 多重免疫组织化学分析。所有荧光团都被分配了伪彩,如图所示。
Order Information # 91044
产品包括 体积 反应性 同型
CD68 (D4B9C) XP® Rabbit mAb (SignalStar Conjugate 0007) 50 µl H 兔 IgG
Complementary Oligo (CO-0007-750) 22 µl  

产品使用信息

应用 稀释度
SignalStar™ Leica Bond 1:50 - 1:200
SignalStar 手册 1:50 - 1:200

保存

SignalStar 偶联物保存在 PBS(pH 值为 7.2)、低于 0.1% 叠氮化钠、2 mM EDTA、0.05% Triton X-100、2 mg/mL BSA 和 50% 甘油中。互补寡核苷酸保存在无核酸酶的水中。储存于 -20°C 的温度下。切勿分装抗体。‭ 在建议的温度保存时,该试剂盒中所有组分均稳定至少 12 个月。

产品说明

SignalStar 多重免疫组织化学 (IHC) 是一种先进技术,使用特定的一抗和荧光检测试剂同时标记组织样品中的多种蛋白质。该技术在可视化和分析蛋白质表达方面具有准确性和可靠性,同时保持了空间背景和组织结构。

SignalStar Oligo-Antibody Pairs 与 SignalStar Multiplex IHC Buffer Kits 兼容,可用于荧光多重成像实验。本产品包含在多达 10 个切片上标记靶标蛋白所需的寡核苷酸偶联抗体和互补寡核苷酸。SignalStar Multiplex IHC Buffer Kits 是扩增和成像靶标信号所必需的。使用 SignalStar Multiplex IHC Panel Builder,可以方便地将多个寡核苷酸抗体对组合成多重检测板。SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂并不与推荐用于免疫组织化学分析的所有 Cell Signaling Technology® 产品和实验步骤都兼容。

实验步骤

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产品信息:

signalstar-8plex  

储存:所有试剂盒组分都储存于 -20°C。

稳定性:在建议的温度下保存时,该试剂盒中的所有组分均可保持稳定至少 12 个月。不得超过 5 次冻融循环。

应用:SignalStar 试剂盒适用于进行荧光多重免疫组织化学分析。

载玻片数目:该试剂盒包含足够 10 张载玻片染色的材料。

SignalStar Symbols

目录


1 简介:SignalStar™ 染色方法


SignalStar 多重免疫组织化学 (mIHC) 是一种采用抗体、寡核苷酸 (oligos) 和荧光团探究细胞存在情况、位置、功能和生物标记物共表达模式的技术。SignalStar 技术使得在维持空间背景和组织结构的同时检测多个表型靶标与功能靶标成为可能。这些洞见对了解细胞如何组织并相互作用以影响组织微环境及推动疾病进展和对治疗作出反应至关重要。

SignalStar 系统的力量依赖于 SignalStar 抗体设计。这些抗体已就用于福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 的组织中经过严格验证,并且随后使用位点特异性偶联和彻底纯化方法偶联至唯一寡核苷酸标签。使用高度特异的互补性寡核苷酸和荧光团网络,科学家可以放大 3-8 个靶标的信号,即使这些靶标为低丰度亦如此。

SignalStar Multiplex IHC WorkFlow Diagram

图 1. 将您所选像素尺寸(最多 3-8 种唯一寡核苷酸偶联抗体)下的所有抗体按混合物在一个第一孵育步骤中添加。带荧光染料(信道:488、594、647 和 750)的互补性寡核苷酸通过构造与抗体接合的寡核苷酸-荧光团结构体,在第一轮成像中放大多达 4 种寡核苷酸偶联抗体的信号。如果像素尺寸大于 4,则柔和移除第一轮的寡核苷酸和荧光团,并且进行第二轮放大以可视化多达 4 种额外的寡核苷酸偶联抗体;互补性寡核苷酸系统和使用荧光团移除过程使得从同一底物放大第二轮抗体成为可能,同时无交叉反应性。然后将 2 幅图像用专有或开源软件以计算方式对齐并融合,以生成由多达 8 个靶标组成的图像。

2 溶液和试剂


2.1 包含的试剂盒组分

试剂盒中包含的材料
多达 8 种 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体(见下文)
多达 8 种 SignalStar 互补性寡核苷酸(见下文)
SignalStar™ 抗体稀释液 A
SignalStar™ 抗体稀释液 B
SignalStar™ 放大缓冲液 A
SignalStar™ 放大缓冲液 B
SignalStar™ 放大寡核苷酸套装 A:
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ 放大寡核苷酸套装 B:
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ 连接缓冲液
T4 DNA 连接酶 (5 U/μL)
ATP (100 mM)
10X 双链 DNA 酶缓冲液
双链 DNA 酶
 

包括多达 8 种 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 (A) 和多达 8 种 SignalStar 互补性寡核苷酸 (B),订购时选定并随各自寡核苷酸-抗体对 (C) 成套提供。请参见以下示例。

SignalStar Oligo Antibodies

2.2 不包括所要求的试剂

  • Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
  • DAPI #4083
  • ProLong Gold Antifade Reagent #9071
  • Nuclease-free Water #12931
  • 10% 中性缓冲福尔马林
  • 低吸附移液器吸头

2.3 不含所需的试剂 - 可从 Leica Biosystems 获得

  • BOND 研究检测系统 #DS9455
  • BOND 抽吸探针清洁套件 #CS9100
  • BOND 滴定试剂盒(10 个容器,50 个插管)#OPT9049
  • BOND 开放式容器 30 mL(10 包)#OP309700
  • BOND 开放式容器 7 mL(10 包)#OP79193
  • BOND 通用覆盖物(160 包)#S21.4611
  • BOND TM 表位修复 2-1 L (RTU) #AR9640
  • BOND 脱蜡液 1 L (RTU) #AR9222
  • BOND 清洗液 10X 浓缩液,1L #AR9590

3 开始之前的重要考虑事项


Warning

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。 对于每个荧光信道,成像轮次可以含有仅 1 种互补性性寡核苷酸。切勿在相同成像轮次合并相同荧光信道专属的互补性寡核苷酸,因为这会使分析结果不可解读。

 
Warning

切勿合并来自不同检验组合的抗体。 如果您同时运行多个检验组合,则必须为每个检验组合生成单独的抗体/互补性寡核苷酸混合物。

Caution

在创建溶液之前,使用 BOND RX 软件设置实验步骤和试剂。 创建容器、实验步骤和新的 BOND 研究检测系统。需要 BOND 研究检测系统才能运行此实验步骤。

Caution

执行每轮 SignalStar 检测后,始终对 BOND RX 进行吸液探针清洁。

Caution

请确认您的 SignalStar 检验组合设计是否要求 2 轮成像。 利用本文档第 10.1 节和第 9.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例SignalStar 检验组合设计工作表,获取指导和帮助。

Caution

确认您的显微镜可以检出此试剂盒提供的荧光团。 成像时,除 DAPI 外,还存在 4 个需要采集的荧光信道。

 
荧光团信道 激发 (nm) 发射 (nm) 激光线 通用滤光片套装
488 488 520 488 FITC
594 590 618 561/594 德克萨斯红
647 650 668 594/633 Cy®5
750 752 776 633 Cy®7
Note

建议应通过将单张染色的载玻片对上述光谱成像,创建光谱库。 这将使得更好解混成为可能,以帮助最大限度降低光谱渗透的可能性。

Note

建议使用 DAPI 浓缩物,而不是含 DAPI 的封固剂。 DAPI 亮染便利更好地对齐图像。

Caution

如果溶液未充分混合,荧光信号可能变动或减弱。 使用前,将每种试剂以 1,000 rpm 的速度旋转 30 秒,然后通过吸取缓慢混匀。 使用试剂时,缓慢移液以确保准确度。不使用时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液。

Caution

载玻片最好应在完成染色的 8 小时以内成像。 如果载玻片未在这个时间段以内成像,则荧光信号可能减弱。

Note

如果对本实验步骤有任何偏离,则结果得不到保证。 SignalStar 实验步骤用指定的抗原修复步骤和染色步骤制定并优化。

Note

建议使用阳性对照载玻片。 每次运行中应纳入一种组织,其中显色性染色已经对该组织确认多重检验组合中存在所有靶标。

Note

建议应按 1:100 使用每种抗体。 但是,供应了足够的抗体试剂以便按 1:50 或 1:200 稀释度使用。

4 BOND RX 自动染色机设置


Caution

在创建溶液之前,使用 BOND RX 软件设置实验步骤和试剂。需要 BOND RX 软件版本 7.0 或更高版本。

4.1 在 BOND RX 自动染色机上创建新试剂

必须在 BOND RX 软件上为 SignalStar 测定法创建以下试剂:

BOND 滴定容器

 

1. MARKER(= SignalStar 染色溶液)

 

2. SignalStar 放大液 1

 

3. SignalStar 放大液 2

 

4. SignalStar 连接溶液

 

5. SignalStar 荧光移除液

BOND 7 mL 开放式容器

 

6. 10% 中性缓冲福尔马林

Caution

创建 10% 中性缓冲福尔马林试剂时选择“危险”,以确保废物得到妥善处理。

BOND 30 mL 开放式容器

 

7. 0.1X TBST

 

8. 1X TBST(连接 BOND 研究检测系统所需)

4.2 BOND 研究检测系统设置

 

1. 创建一个名为“CST SignalStar”的新 BOND 研究检测系统。

 

2. 将带有 1X TBST 的 30 mL 开放式容器连接至 CST SignalStar BOND 研究检测系统。

Caution

步骤 2 中的开放式容器必须明确命名(例如,“1X TBST”而不是“0.1X TBST”)。

4.3 针对 SignalStar 第 1 轮成像和第 2 轮成像创建 BOND RX 实验步骤

 

1. 在 BOND RX 软件中,选择“实验步骤设置”选项卡。

 

2. 选择“*IF 实验步骤”(确保“修改者”列中列出的是 Leica)。

 

3. 复制实验步骤并将其重命名为“CST SignalStar 第 1 轮成像”。添加缩写名称“CST Rd1”。

 

4. 选择“显示清洗步骤”。

 
5. 
 
删除所有步骤,并添加标题为“BOND RX 实验步骤设置清单:第 1 轮成像”的文档中第 9.2 节中的步骤。

 

 

6. 选择“CST SignalStar”作为首选检测系统。

 

7. 选择“创建实验步骤”。

 

8. 单击“保存”,然后单击“是”以确认警告消息。

 

9. 创建“CST SignalStar 第 1 轮成像”实验步骤的副本。

 

10. 将副本名称更改为“CST SignalStar 第 2 轮成像”,其缩写为“CST Rd2”。

 

11. 选择“显示清洗步骤”。

 
12. 
 
删除步骤 1-11,并添加标题为“BOND RX 实验步骤设置清单:成像轮次”的文档中第 9.3 节中的步骤 1-10。
 

13. 选择“CST SignalStar”作为首选检测系统。

 

14. 选择“创建实验步骤”。

 

15. 单击“保存”,然后单击“是”以确认警告消息。

5 SignalStar 第 1 轮成像:溶液制备


Warning

必须在适当的 BOND RX 容器中或 BOND 滴定套件 (#OPT9049) 的插管中使用每种试剂,以便检测正常运行。 请参阅下表,以了解在 BOND RX 自动染色机上执行 SignalStar 检测所需的容器或插管的数量。

Warning

请勿将打开的容器装得过满。如果容器装得太满,BOND RX 自动染色机将认为容器是“空的”。

 

试剂

BOND 容器
所需的容器数量
5 块载玻片 10 块载玻片
SignalStar 第 1 轮成像溶液 BOND 6 mL 滴定插管 1 1
SignalStar 放大液 1 BOND 6 mL 滴定插管 1 2
SignalStar 放大液 2 BOND 6 mL 滴定插管 1 2
SignalStar 连接溶液 BOND 6 mL 滴定插管 1 1
10% 中性缓冲福尔马林 BOND 7 mL 开放式容器 1 1
0.1X TBST 溶液 BOND 30 mL 开放式容器 2 3
1X TBST 溶液 BOND 30 mL 开放式容器 1 1

5.1 第 1 轮成像:SignalStar 溶液

Caution

一旦配制,SignalStar 第 1 轮成像液应包含随试剂盒(包括用于第 1 轮成像和第 2 轮成像的抗体)订购的所有抗体(最多 8 种)以及用于第 1 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 10.1 节和第 9.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例SignalStar 检验组合设计工作表,获取指导和帮助。

Warning

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管,以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 抗体稀释液 A 770 1,295
SignalStar 抗体稀释液 B 330 555
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 1 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 2 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 3 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 4(如需要 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 5(如需要 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 6(如需要 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 7(如需要 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 8(如需要 11 18.5
第 1 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 1 11 18.5
第 1 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 2 11 18.5
第 1 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 3 11 18.5
第 1 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 4(如果需要 11 18.5
总体积 1,232 2,072

5.2 第 1 轮成像:SignalStar 放大液 1

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管,以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液。

Caution

对于 10 张载玻片运行,在锥形管中补充总体积,旋转 20 分钟,然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 放大缓冲液 A 2,425 4,675
SignalStar 放大缓冲液 B 2,425 4,675
SignalStar 放大寡核苷酸 A-488 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 A-594 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 A-647 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 A-750 48.5 93.5
总体积 5,044 9,724

5.3 第 1 轮成像:SignalStar 放大液 2

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管,以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液。

Caution

对于 10 张载玻片运行,在锥形管中补充总体积,旋转 20 分钟,然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 放大缓冲液 A 2,425 4,675
SignalStar 放大缓冲液 B 2,425 4,675
SignalStar 放大寡核苷酸 B-488 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 B-594 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 B-647 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 B-750 48.5 93.5
总体积 5,044 9,724

5.4 第 1 轮成像:SignalStar 连接溶液

Caution

将以下试剂合并到一个 BOND 滴定插管中。用护膜覆盖并涡旋 10 秒。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液。

 

试剂盒组分/试剂
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液 550 925
Nuclease-free Water #12931 517 869.5
T4 DNA 连接酶 (5 U/μL) 22 37
ATP (100 mM) 11 18.5
总体积 1,100 1,850

5.5 不包括额外的所需溶液

 
  • 含 Tween 20 (TBST) 的 0.1X Tris 盐缓冲液 (TBST):要制备 500 mL 1X TBST,添加 5 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 至 495 ml dH2O 中。装满 30 mL BOND 开放式容器(2 个容器用于 5 张载玻片,3 个容器用于 10 张载玻片)。避免在制备过程中产生气泡。
  • 含 Tween 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液 (TBST):要制备 500 mL 1X TBST,添加 50 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 至 450 ml dH2O 中。装满 30 mL BOND 开放式容器(1 个容器用于 5 张或 10 张载玻片)。避免在制备过程中产生气泡。
  • 10% 中性缓冲福尔马林:在实验室通风橱中,装满 7 mL BOND 开放式容器。

6 SignalStar 第 1 轮成像:使用的 BOND RX 实验步骤


6.1 载玻片烘干

Note

可以在您开始实验前当天烘干载玻片。这个步骤允许固体石腊熔化。

  1. 在 60°C 孵育载玻片 30 分钟。

6.2 运行 BOND RX 实验步骤

  2. 在 BOND RX 软件中,创建研究并添加载玻片。
  3. “添加载玻片”时,使用以下选项在 BOND 上制备组织:
  1. 载玻片制备:脱蜡
  2. 分装量:150 μL
  3. HIER:ER2 40 分钟
  4. 选择“SignalStar 第 1 轮成像”作为实验步骤,并针对每个载玻片选择“HIER ER2 40 分钟”。
  5. 打印标签,贴在载玻片上,并将载玻片添加到 BOND 载玻片托盘。
  6. 将 BOND 覆盖物放在载玻片上,确保它们正确放置在托盘中。
Caution

最好确认第 1 轮成像实验步骤中的每个步骤都正确无误。 请使用第 9.2 节中的清单,以协助创建您的实验步骤。

Caution

确保下面列出的所选 0.1X TBST 清洗设置为“打开”。 如果不“打开”清洗,则荧光信号可能会变动或减弱。确认总共有 6 个 SignalStar 放大液 1 步骤和 6 个 SignalStar 放大液 2 步骤。

Caution

确认散装 Bond 洗涤液容器已装满,且废物容器为空。

  7. 启动运行 BOND RX。
Warning

立即启动运行 BOND RX 染色,请勿使用延迟启动。染色完成后,载玻片可以在 BOND RX 自动染色机上放置过夜。

  8. 从 BOND RX 自动染色机中取出载玻片并放入 0.1X TBST 中。
  9. 在 BOND RX 自动染色机上运行抽吸探针清洁。按照常规程序清洁覆盖物。
  10. 根据数据表说明,配制 DAPI #4083 溶液。
  11. 用 DAPI 溶液复染。
  12. 将载玻片浸没于 0.1X TBST 中 30 秒。
  13. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封固。
  14. 在 8 小时内对载玻片进行成像。
Caution

一旦载玻片脱蜡或取下盖玻片,任何时候切勿让它们干透。

7 SignalStar 第 2 轮成像:溶液制备


Warning

必须在适当的 BOND RX 容器中或 BOND 滴定套件 (#OPT9049) 的插管中使用每种试剂,以便检测正常运行。 请参阅下表,以了解在 BOND RX 自动染色机上执行 SignalStar 检测所需的容器或插管的数量。

Warning

请勿将打开的容器装得过满。如果容器装得太满,BOND RX 自动染色机将认为容器是“空的”。

 

试剂

BOND 容器
所需的容器数量
5 块载玻片 10 块载玻片
SignalStar 第 2 轮成像液 BOND 6 mL 滴定插管 1 1
SignalStar 放大液 1 BOND 6 mL 滴定插管 1 2
SignalStar 放大液 2 BOND 6 mL 滴定插管 1 2
SignalStar 连接溶液 BOND 6 mL 滴定插管 1 1
10% 中性缓冲福尔马林 BOND 7 mL 开放式容器 1 1
0.1X TBST 溶液 BOND 30 mL 开放式容器 2 3
1X TBST 溶液 BOND 30 mL 开放式容器 1 1
SignalStar 荧光移除液 BOND 6 mL 滴定插管 1 1

7.1 第 2 轮成像:SignalStar 溶液

Caution

一旦配制,SignalStar 第 2 轮成像液应仅包含用于第 2 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 10.1 节和第 9.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例SignalStar 检验组合设计工作表,获取指导和帮助。

Warning

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管,以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液。

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 抗体稀释液 A 770 1,295
SignalStar 抗体稀释液 B 330 555
第 2 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 5 11 18.5
第 2 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 6 (如果需要 11 18.5
第 2 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 7 (如果需要 11 18.5
第 2 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 8 (如果需要 11 18.5
总体积 1,144 1,924

7.2 第 2 轮成像:SignalStar 放大液 1

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管,以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液。

Caution

对于 10 张载玻片运行,在锥形管中补充总体积,旋转 20 分钟,然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 放大缓冲液 A 2,425 4,675
SignalStar 放大缓冲液 B 2,425 4,675
SignalStar 放大寡核苷酸 A-488 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 A-594 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 A-647 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 A-750 48.5 93.5
总体积 5,044 9,724

7.3 第 2 轮成像:SignalStar 放大液 2

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管,以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液。

Caution

对于 10 张载玻片运行,在锥形管中补充总体积,旋转 20 分钟,然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 放大缓冲液 A 2,425 4,675
SignalStar 放大缓冲液 B 2,425 4,675
SignalStar 放大寡核苷酸 B-488 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 B-594 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 B-647 48.5 93.5
SignalStar 放大寡核苷酸 B-750 48.5 93.5
总体积 5,044 9,724

7.4 第 2 轮成像:SignalStar 连接溶液

Caution

在 1 个 BOND 滴定插管中混合以下试剂。用护膜覆盖并涡旋 10 秒。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液。

 

试剂盒组分/试剂
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液 550 925
Nuclease-free Water #12931 517 869.5
T4 DNA 连接酶 (5 U/μL) 22 37
ATP (100 mM) 11 18.5
总体积 1,100 1,850

7.5 第 2 轮成像:SignalStar 荧光移除液

Caution

在 1 个 BOND 滴定插管中混合以下试剂。用护膜覆盖并涡旋 10 秒。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后,应立即使用 SignalStar 溶液。

 

试剂盒组分/试剂
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
10X 双链 DNA 酶缓冲液 185 335
双链 DNA 酶 18.5 33.5
Nuclease-free Water #12931 1,646.5 2,981.5
总体积 1,850 3,350

7.6 不包括额外的所需溶液

 
  • 含 Tween 20 (TBST) 的 0.1X Tris 盐缓冲液 (TBST):要制备 500 mL 1X TBST,添加 5 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 至 495 ml dH2O 中。装满 30 mL BOND 开放式容器(2 个容器用于 5 张载玻片,3 个容器用于 10 张载玻片)。避免在制备过程中产生气泡。
  • 含 Tween 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液 (TBST):要制备 500 mL 1X TBST,添加 50 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 至 450 ml dH2O 中。装满 30 mL BOND 开放式容器(1 个容器用于 5 张或 10 张载玻片)。避免在制备过程中产生气泡。
  • 10% 中性缓冲福尔马林:在实验室通风橱中,装满 7 mL BOND 开放式容器。

8 SignalStar 第 2 轮成像:使用的 BOND RX 实验步骤


  1. 采集 SignalStar 第 1 轮成像中的图像后,将载玻片浸泡于 dH2O 中 >30 分钟,以轻柔取下盖玻片。
Caution

一旦载玻片脱蜡或取下盖玻片,任何时候切勿让它们干透。

  2. 在 BOND RX 软件中,创建研究并添加载玻片。
  3. “添加载玻片”时,使用以下选项在 BOND 上制备组织:
  1. 载玻片制备:--(无值/不需要)
  2. 分装量:150 μL
  3. HIER:--(无值/不需要)
  4. 选择“CST SignalStar 第 2 轮成像”,确保载玻片制备被选为“--”,HIER 被选为“--”。
  5. 打印标签,向载玻片添加标签,并将载玻片放置在 BOND 载玻片托盘上。
  6. 在添加 BOND 覆盖物之前,将 2-3 滴 dH2O 滴到每张载玻片上。
Warning

重要提示:第 2 轮放大无需脱蜡和 HIER(抗原修复)。如果使用脱蜡和 HIER,第 2 轮放大结果将不可解读。

Caution

最好确认第 2 轮成像实验步骤中的每个步骤都正确无误。 请使用第 9.3 节中的清单,以协助创建您的实验步骤。

Caution

确保下面列出的所选 0.1X TBST 清洗设置为“打开”。如果不“打开”清洗,则荧光信号可能会变动或减弱。确认总共有 6 个 SignalStar 放大液 1 步骤和 6 个 SignalStar 放大液 2 步骤。

Caution

确认散装 Bond 洗涤液容器已装满,且废物容器为空。

  7. 启动运行 BOND RX。
Warning

立即启动运行 BOND RX 染色,请勿使用延迟启动。染色完成后,载玻片可以在 BOND RX 自动染色机上放置过夜。

  8. 从 BOND RX 自动染色机中取出载玻片并放入 0.1X TBST 中。
  9. 在 BOND RX 自动染色机上运行抽吸探针清洁。按照常规程序清洁覆盖物。
  10. 根据数据表说明,配制 DAPI #4083 溶液。
  11. 用 DAPI 溶液复染。
  12. 将载玻片浸没于 0.1X TBST 中 30 秒。
  13. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封固。
  14. 在 8 小时内对载玻片进行成像。
Caution

一旦载玻片脱蜡或取下盖玻片,任何时候切勿让它们干透。

9 用户工作表


9.1 SignalStar 检验组合设计工作表

寡核苷酸偶联抗体 互补性寡核苷酸 产品对编号 488 594 647 750
               
               
               
               
               
               
               
               

(参见附录 10.1,了解检验组合设计示例)

9.2 BOND RX 实验步骤设置清单:第 1 轮成像

BOND 步骤 试剂 步骤类型 孵育时间(分钟) 温度 (C) 分配类型
1 *去离子水 洗涤 0:00 环境 150 µL
2 *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
3 *去离子水 洗涤 0:00 环境 150 µL
4 0.1X TBST 溶液 洗涤 0:00 环境 150 µL
5 MARKER(SignalStar 第 1 轮成像液) 主要 40:00 环境 150 µL
6 1X TBST 溶液 试剂 5:00 环境 打开
7 0.1X TBST 溶液 试剂 5:00 环境 150 µL
8 10% 中性缓冲福尔马林 试剂 5:00 环境 150 µL
9 *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
10 *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
11 *去离子水 洗涤 0:00 环境 150 µL
12 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
13 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
14 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
15 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
16 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
17 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
18 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
19 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
20 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
21 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
22 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
23 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
24 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
25 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
26 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
27 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
28 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
29 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
30 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
31 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
32 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
33 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
34 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
35 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
36 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
37 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
38 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
39 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
40 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
41 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
42 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
43 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
44 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
45 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
46 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
47 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
48 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
49 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
50 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
51 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
52 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
53 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
54 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
55 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
56 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
57 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
58 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
59 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
60 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
61 SignalStar 连接溶液 试剂 20:00 环境 150 µL
62 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
63 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
64 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
65 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
66 BOND 洗涤液 洗涤 0:00 环境 150 µL

9.3 BOND RX 实验步骤设置清单:第 2 轮成像

BOND 步骤 试剂 步骤类型 孵育时间(分钟) 温度 (C) 分配类型
1 0.1X TBST 溶液 洗涤 0:00 环境 打开
2 0.1X TBST 溶液 洗涤 0:00 环境 打开
3 SignalStar 洗脱缓冲液 试剂 60:00 37° 150 µL
4 SignalStar 洗脱缓冲液 试剂 60:00 37° 150 µL
5 *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
6 *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
7 *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
8 MARKER(SignalStar 第 2 轮成像液) 主要 40:00 环境 150 µL
9 1X TBST 溶液 试剂 5:00 环境 打开
10 0.1X TBST 溶液 试剂 5:00 环境 打开
11 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
12 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
13 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
14 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
15 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
16 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
17 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
18 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
19 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
20 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
21 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
22 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
23 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
24 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
25 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
26 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
27 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
28 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
29 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
30 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
31 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
32 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
33 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
34 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
35 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
36 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
37 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
38 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
39 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
40 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
41 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
42 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
43 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
44 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
45 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
46 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
47 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
48 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
49 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
50 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
51 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
52 SignalStar 放大液 1 试剂 8:00 环境 150 µL
53 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
54 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
55 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
56 SignalStar 放大液 2 试剂 16:00 环境 150 µL
57 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
58 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
59 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
60 SignalStar 连接溶液 试剂 20:00 环境 150 µL
61 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
62 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
63   BOND 洗涤液 洗涤 0:00 环境 150 µL

10 附录


10.1 SignalStar 检验组合设计示例

寡核苷酸偶联抗体 互补性寡核苷酸 产品对编号 488 594 647 750
PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J)
XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0008)
Complementary Oligo
(CO-0008-488)
17942 1      
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0005)
Complementary Oligo
(CO-0005-594)
28249 1      
TIM-3 (D5D5R™) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0010)
Complementary Oligo
(CO-0010-647)
15231 1      
Ki-67 (8D5) Mouse mAb
(SignalStar™ Conjugate 0014)
Complementary Oligo
(CO-0014-750)
56398 1      
CD8ɑ (D8A8Y) Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0004)
Complementary Oligo
(CO-0004-488)
45747 2      
CD68 (D4B9C) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0007)
Complementary Oligo
(CO-0007-594)
77318 2      
CD20 (E7B7T) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0011)
Complementary Oligo
(CO-0011-647)
36775 2      
Pan-Keratin (C11) Mouse mAb
(SignalStar™ Conjugate 0003)
Complementary Oligo
(CO-0003-750)
97227 2      

10.2 故障排除和常见问题

如何验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂?

CST 彻底验证了 SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 菜单中可提供的每种抗体。通过滴定和荧光团配对以及在两轮成像中测试抗体的各种组合。对各种肿瘤和组织类型进行测试。我们还严格测试了传统显色测定法中使用的亲本抗体,因这些抗体充当这种荧光测定法的基础。

该测定法是否对冷冻组织有效?

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒与试剂可用于冷冻组织。我们正在验证我们的抗体和实验步骤是否能用于新鲜组织或冷冻组织。

你们是否有抗小鼠抗体可提供?

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂可用于小鼠组织。我们正在验证小鼠反应性抗体。

我没在你们的可提供抗体菜单中看到我感兴趣的靶标。我还能以某种方式在我的检测板中使用它吗?

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂可配合我公司菜单以外的抗体使用。我们正在开发诸多定制解决方案以便在 SignalStar Multiplex IHC 测定法中使用您的自有抗体。

我能否将此检测中使用的抗体与直接偶联物组合?

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂可与直接偶联物组合使用。有可能将直接偶联物并入您的实验步骤。然而,由于 SignalStar 试剂受益于荧光信号放大,因此可能存在光谱渗出,后者因使用偶联物未放大的测定法产生。

将我的 SignalStar 染色与连续载玻片上的显色性染色比较时,我看到更多阳性细胞。我如何知道这种过度染色是否正确?

在优化期间,我们发现荧光染色可能显示比显色性染色更高的阳性百分比。为确保任何过度染色为特异性,请确认用其他染色剂证明亚细胞定位和共定位正确。例如,如果所有 CD8 细胞都为 CD3,则任何与显色性染色相比的 CD8过度染色很可能是正确的。

完成染色后我可能等多久才对切片成像?

对于第 1 轮成像,在完成染色后 8 小时内成像时,染色应显示稳定信号。对于第 2 轮成像,成像应尽可能接近于染色完成时进行,但是应当保持稳定长达 8 小时。

我是否需要针对自己正在使用的组织类型优化 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂?

SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂已针对抗体的荧光团配对和顺序作了优化。由于组织在靶标的质量和表达水平方面不同,将您的检验组合中抗体的浓度升高 2 倍或降低 0.5 倍可能有助在您的实验中实现最佳信号。

该测定法中应包括哪种适当的阳性对照?是否需要多个对照?

通过显色性 IHC 证明每个靶标呈阳性的任何组织都可以充当阳性对照组织。因此,每个靶标都将要求阳性对照,这有时可能导致多个对照必不可少。为了最佳比较,各切片应尽可能连续。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology、XP 和 SignalStar 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。E1L3N 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。Cy 和 CyDye 是 GE Healthcare 的注册商标。所有其他商标均属各自所有者专有。访问我们的商标信息页面。© 2023 Cell Signaling Technology, Inc. 版权所有。

发布​时间 2023 年 7 月

实验步骤编号:2966

产品信息:

signalstar-8plex  

储存:所有试剂盒组分都储存于 -20°C。

稳定性:在建议的温度下保存时,该试剂盒中的所有组分均可保持稳定至少 12 个月。不得超过 5 次冻融循环。

应用:SignalStar 试剂盒适用于进行荧光多重免疫组织化学分析。

载玻片数目:该试剂盒包含足够 10 张载玻片染色的材料。

SignalStar Symbols

目录


1 简介:SignalStar™ 染色方法


SignalStar™ 多重免疫组织化学 (mIHC) 是一种采用抗体、寡核苷酸(oligos)和荧光团探究细胞存在情况、位置、功能和生物标记物共表达模式的技术。SignalStar 技术使得在维持空间背景和组织结构的同时检测多个表型靶标与功能靶标成为可能。这些洞见对了解细胞如何组织并相互作用以影响组织微环境及推动疾病进展和对治疗作出反应至关重要。

SignalStar 系统的力量依赖于 SignalStar 抗体设计。这些抗体已就用于福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 的组织中经过严格验证,并且随后使用位点特异性偶联和彻底纯化方法偶联至唯一寡核苷酸标签。使用高度特异的互补性寡核苷酸和荧光团网络,科学家可以放大 3-8 个靶标的信号,即使这些靶标为低丰度亦如此。

SignalStar Multiplex IHC WorkFlow Diagram

图 1. 将您所选像素尺寸(最多 3-8 种唯一寡核苷酸偶联抗体)下的所有抗体按混合物在一个第一孵育步骤中添加。带荧光染料(信道:488、594、647 和 750)的互补性寡核苷酸通过构造与抗体接合的寡核苷酸-荧光团结构体,在第一轮成像中放大多达 4 种寡核苷酸偶联抗体的信号。如果像素尺寸大于 4,则柔和移除第一轮的寡核苷酸和荧光团,并且进行第二轮放大以可视化多达 4 种额外的寡核苷酸偶联抗体;互补性寡核苷酸系统和使用荧光团移除过程使得从同一底物放大第二轮抗体成为可能,同时无交叉反应性。然后将 2 幅图像用专有或开源软件以计算方式对齐并融合,以生成由多达 8 个靶标组成的图像。

2 溶液和试剂


2.1 包含的试剂盒组分

试剂盒中包含的材料
多达 8 种 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体(见下文)
多达 8 种 SignalStar 互补性寡核苷酸(见下文)
SignalStar™ 抗体稀释液 A
SignalStar™ 抗体稀释液 B
SignalStar™ 放大缓冲液 A
SignalStar™ 放大缓冲液 B
SignalStar™ 放大寡核苷酸套装 A:
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ 放大寡核苷酸套装 B:
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ 连接缓冲液
T4 DNA 连接酶 (5 U/μL)
ATP (100 mM)
10X 双链 DNA 酶缓冲液
双链 DNA 酶
 

包括多达 8 种 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 (A) 和多达 8 种 SignalStar 互补性寡核苷酸 (B),订购时选定并随各自寡核苷酸-抗体对 (C) 成套提供。请参见以下示例。

SignalStar Oligo Antibodies

2.2 不包括所要求的试剂

  • SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747
  • 二甲苯(用于脱蜡)
  • 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)
  • Decloaking Chamber (Biocare Medical, #DC2012)
  • Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
  • DAPI #4083
  • ProLong Gold Antifade Reagent #9071
  • Nuclease-free Water #12931
  • 10% 中性缓冲福尔马林
  • 低吸附移液器吸头
  • 载玻片处理容器
  • 疏水屏障笔
  • 玻璃盖片
  • 带电荷载玻片
  • 对照组织

3 开始之前的重要考虑事项


Warning

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。 对于每个荧光信道,成像轮次可以含有仅 1 种互补性性寡核苷酸。切勿在相同成像轮次合并相同荧光信道专属的互补性寡核苷酸,因为这会使分析结果不可解读。

 
Warning

切勿合并来自不同检验组合的抗体。 如果您同时运行多个检验组合,则必须为每个检验组合生成单独的抗体/互补性寡核苷酸混合物。

Caution

请确认您的 SignalStar 检验组合设计是否要求 2 轮成像。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计SignalStar 检验组合设计工作表,获取指导和帮助。

Caution

确认您的显微镜可以检出此试剂盒提供的荧光团。 成像时,除 DAPI 外,还存在 4 个需要采集的荧光信道。

 
荧光团信道 激发 (nm) 发射 (nm) 激光线 通用滤光片套装
488 488 520 488 FITC
594 590 618 561/594 德克萨斯红
647 650 668 594/633 Cy®5
750 752 776 633 Cy®7
Note

建议应通过将单张染色的载玻片对上述光谱成像,创建光谱库。 这将使得更好解混成为可能,以帮助最大限度降低光谱渗透的可能性。

Note

建议使用 DAPI 浓缩物,而不是含 DAPI 的封固剂。 DAPI 亮染便利更好地对齐图像。

Caution

如果溶液未充分混合,荧光信号可能变动或减弱。 使用低吸附移液器吸头合并 SignalStar 试剂盒所有组分,并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。 不使用时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

Caution

载玻片最好应在完成染色的 12 小时以内成像。 如果载玻片未在这个时间段以内成像,则荧光信号可能减弱。

Note

如果对本实验步骤有任何偏离,则结果得不到保证。 SignalStar 实验步骤用指定的抗原修复步骤和染色步骤制定并优化。

Note

建议使用阳性对照载玻片。 每次运行中应纳入一种组织,其中显色性染色已经对该组织确认多重检验组合中存在所有靶标。

Note

建议应按 1:100 使用每种抗体。 但是,供应了足够的抗体试剂以便按 1:50 或 1:200 稀释度使用。

Note

在整个染色过程中,尽可能沥干孵育液和 dH2O,同时不允许载玻片干透。 在每个步骤之后,从每张载玻片彻底拂去液体,然后继续下一个步骤。

4 SignalStar 第 1 轮成像:溶液制备


4.1 第 1 轮成像:SignalStar 溶液

Caution

一旦配制,SignalStar 第 1 轮成像液应包含随试剂盒(包括用于第 1 轮成像和第 2 轮成像的抗体)订购的所有抗体(最多 8 种)以及用于第 1 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例SignalStar 检验组合设计工作表,获取指导和帮助。

Warning

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 抗体稀释液 A 525 1,050
SignalStar 抗体稀释液 B 225 450
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 1 7.5 15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 2 7.5 15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 3 7.5 15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 4(如需要 7.5 15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 5(如需要 7.5 15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 6(如需要 7.5 15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 7(如需要 7.5 15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 8(如需要 7.5 15
第 1 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 1 7.5 15
第 1 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 2 7.5 15
第 1 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 3 7.5 15
第 1 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 4(如果需要 7.5 15
总体积 840 1,680

4.2 第 1 轮成像:SignalStar 放大液 1

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 放大缓冲液 A 3,000 6,000
SignalStar 放大缓冲液 B 3,000 6,000
SignalStar 放大寡核苷酸 A-488 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 A-594 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 A-647 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 A-750 60 120
总体积 6,240 12,480

4.3 第 1 轮成像:SignalStar 放大液 2

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 放大缓冲液 A 3,000 6,000
SignalStar 放大缓冲液 B 3,000 6,000
SignalStar 放大寡核苷酸 B-488 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 B-594 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 B-647 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 B-750 60 120
总体积 6,240 12,480

4.4 第 1 轮成像:SignalStar 连接溶液

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用

 

试剂盒组分/试剂
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液 375 750
Nuclease-free Water #12931 352.5 705
T4 DNA 连接酶 (5 U/μL) 15 30
ATP (100 mM) 7.5 15
总体积 750 1,500

4.5 不包括额外的所需溶液

  • 1X EDTA 修复液:要制备 250 mL 的 1X EDTA 修复液,使用 225 mL 的 dH2O 稀释 25 ml 的 SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747
  • 10% 中性缓冲福尔马林
  • 含 Tween 20 的 1X Tris 盐缓冲液 (TBST):要制备 1L 1X TBST,添加 10 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 至 900 ml dH2O 中,然后混匀。

5 SignalStar 第 1 轮成像:使用的实验步骤


5.1 载玻片烘干

Note

可以在您开始实验前当天烘干载玻片。 这个步骤允许固体石腊熔化。

 

1. 在 60°C 孵育载玻片 30 分钟。

5.2 脱蜡/水化

Caution

一旦载玻片脱蜡,任何时候切勿让它们干透。加湿的孵育箱用于所有孵育步骤。确保每种溶液覆盖整个组织。

 

2. 在二甲苯洗液中孵育切片 3 次,每次 5 分钟。

 

3. 在 100% 乙醇洗液中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。

 

4. 在 95% 乙醇洗液中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。

 

5. 用 dH2O 中清洗切片 2 次,每次 5 分钟。

5.3 抗原修复

Note

建议在高压锅中进行 EDTA 抗原修复,以最大限度修复表位。本实验步骤描述了对 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 建议的条件。设备专用设置和操作说明应用于其它加压蒸煮器。

 
6. 
 
将载玻片放入 250 ml 室温存放的 1X EDTA 修复液中,载玻片放在一个能放 24 个载玻片的载玻片架上。添加空白载玻片以填满载玻片架。
 

7. 将 500 ml dH2O 倒入加压蒸煮器中。

 

8. 将切片夹放入加压蒸煮器,直至接触到隔热板。用载玻片容器盖部分盖住。

Note

可能有利的是,将第二个以 250 mL 水和空白载玻片填充的 24 位载玻片架置入高压锅并用盖子部分盖住。

 

9. 密封蒸煮器室,并继续进行修复。以下为 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 的设置:

  1. SP1 125°C 持续 30 秒
  2. SP2 90°C 持续 10 秒
 

10. 小心使设备通气,随后取下盖子。

 

11. 从去掩蔽室取出载玻片,允许在实验台上冷却 10 分钟。

 
12. 
 
将载玻片容器置于 dH2O 水龙头下,并将水直接添加到载玻片容器中,直至由 dH2O 替换所有 EDTA 为止。

5.4 第 1 轮成像:染色

 

13. 将载玻片在 150 μL SignalStar 第 1 轮成像液中室温孵育 40 分钟。

Note

或者,可以将载玻片在 SignalStar 第 1 轮成像液中 4°C 孵育过夜,以便将实验步骤分成多天进行。

 

14. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。

 

15. 将载玻片在 10% 中性缓冲福尔马林中室温孵育 5 分钟。

 

16. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

5.5 第 1 轮成像:放大

 
17. 
 
使用放大液 1 和 2 进行 8 轮放大。使用第 8.2 节中的 SignalStar 第 1 轮成像清单跟踪进度。每个放大轮次由以下步骤组成:
  1. 将载玻片在 150 μL 放大液 1 中孵育 8 分钟。
  2. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 dH2O 中 30 秒。
  3. 将载玻片在 150 μL 放大液 2 中孵育 8 分钟。
  4. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

5.6 第 1 轮成像:连接

 

18. 将载玻片在 150 μL SignalStar 连接缓冲液中室温孵育 20 分钟。

 

19. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

5.7 第 1 轮成像:图像

 

20. 根据数据表说明,配制 DAPI #4083 溶液。

 

21. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

 

22. 用 DAPI 溶液复染。

 

23. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

 

24. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封固。

 

25. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳定长达 8 小时。

6 SignalStar 第 2 轮成像:溶液制备


Caution

SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例SignalStar 检验组合设计工作表,获取指导和帮助。

6.1 第 2 轮成像:SignalStar 荧光移除液

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

 

试剂盒组分/试剂
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
10X 双链 DNA 酶缓冲液 75 150
双链 DNA 酶 7.5 15
Nuclease-free Water #12931 667.5 1,335
总体积 750 1,500

6.2 第 2 轮成像:SignalStar 溶液

Caution

一旦配制,SignalStar 第 2 轮成像液应仅包含用于第 2 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例SignalStar 检验组合设计工作表,获取指导和帮助。

Warning

不向 SIGNALSTAR 第 2 轮成像液添加抗体-寡核苷酸偶联物。

Warning

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 抗体稀释液 A 525 1,050
SignalStar 抗体稀释液 B 225 450
第 2 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 5 7.5 15
第 2 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 6 (如果需要 7.5 15
第 2 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 7 (如果需要 7.5 15
第 2 轮成像:SignalStar 互补性寡核苷酸 8 (如果需要 7.5 15
总体积 780 1,560

6.3 第 2 轮成像:SignalStar 放大液 1

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 放大缓冲液 A 3,000 6,000
SignalStar 放大缓冲液 B 3,000 6,000
SignalStar 放大寡核苷酸 A-488 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 A-594 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 A-647 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 A-750 60 120
总体积 6,240 12,480

6.4 第 2 轮成像:SignalStar 放大液 2

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

 

试剂盒组分
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 放大缓冲液 A 3,000 6,000
SignalStar 放大缓冲液 B 3,000 6,000
SignalStar 放大寡核苷酸 B-488 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 B-594 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 B-647 60 120
SignalStar 放大寡核苷酸 B-750 60 120
总体积 6,240 12,480

6.5 第 2 轮成像:SignalStar 连接溶液

Caution

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时,所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并,SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

 

试剂盒组分/试剂
所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液 375 750
Nuclease-free Water #12931 352.5 705
T4 DNA 连接酶 (5 U/μL) 15 30
ATP (100 mM) 7.5 15
总体积 750 1,500

7 SignalStar 第 2 轮成像:使用的实验步骤


Caution

SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例SignalStar 检验组合设计工作表,获取指导和帮助。

Note

一旦成像完成,就可以从载玻片移除荧光信号,从而可以进行另一轮成像。在第一轮成像后尽快执行下一组步骤。

7.1 移除荧光信号

 

1. 采集图像后,将载玻片浸泡于 dH2O 中 ≥30 分钟,以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。

 

2. 将载玻片在 150 μL SignalStar 荧光移除液中 37°C 孵育 2 小时。

 

3. 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。

 

4. 可选:

  1. 将载玻片封固在 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 with DAPI #4083 中,并对载玻片成像以确认无荧光信号余留。
  2. 将载玻片浸泡于 dH2O 中 ≥30 分钟,以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。
  3. 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。

7.2 第 2 轮成像:染色

 

5. 将载玻片在 150 μL SignalStar 第 2 轮成像液中室温孵育 40 分钟。

 

6. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

7.3 第 2 轮成像:放大

 
7. 
 
使用放大液 1 和 2 进行 8 轮放大。使用第 8.3 节中的 SignalStar 第 2 轮成像清单跟踪进度。 每个放大轮次由以下步骤组成:
  1. 将载玻片在 150 μL 放大液 1 中孵育 8 分钟。
  2. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 dH2O 中 30 秒。
  3. 将载玻片在 150 μL 放大液 2 中孵育 8 分钟。
  4. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

7.4 第 2 轮成像:连接

 

8. 将载玻片在 150 μL SignalStar 连接缓冲液中室温孵育 20 分钟。

 

9. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

7.5 第 2 轮成像:图像

 

10. 根据数据表说明,配制 DAPI #4083 溶液。

 

11. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

 

12. 用 DAPI 溶液复染。

 

13. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

 

14. 从载玻片彻底拂去液体,然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

 

15. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封固。

 

16. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳定长达 8 小时。

8 用户工作表


8.1 SignalStar 检验组合设计工作表

寡核苷酸偶联抗体 互补性寡核苷酸 488 594 647 750
             
             
             
             
             
             
             
             

(参见附录 9.1,了解检验组合设计示例)

8.2 SignalStar 第 1 轮成像清单

放大轮次 步骤编号 步骤
第 1 轮放大 1 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
2 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
3 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
4 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 2 轮放大 5 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
6 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
7 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
8 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 3 轮放大 9 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
10 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
11 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
12 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 4 轮放大 13 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
14 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
15 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
16 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 5 轮放大 17 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
18 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
19 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
20 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 6 轮放大 21 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
22 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
23 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
24 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 7 轮放大 25 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
26 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
27 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
28 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 8 轮放大 29 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
30 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
31 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
32 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。

8.3 SignalStar 第 2 轮成像清单

放大轮次 步骤编号 步骤
第 1 轮放大 1 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
2 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
3 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
4 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 2 轮放大 5 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
6 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
7 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
8 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 3 轮放大 9 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
10 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
11 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
12 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 4 轮放大 13 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
14 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
15 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
16 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 5 轮放大 17 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
18 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
19 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
20 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 6 轮放大 21 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
22 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
23 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
24 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 7 轮放大 25 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
26 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
27 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
28 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 8 轮放大 29 在 SignalStar™ 放大液 1 中孵育 8 分钟。
30 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
31 在 SignalStar™ 放大液 2 中孵育 8 分钟。
32 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。

9 附录


9.1 SignalStar 检验组合设计示例

寡核苷酸偶联抗体 互补性寡核苷酸 产品对编号 488 594 647 750
PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) XP® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0008) Complementary Oligo
(CO-0008-488)
17942 1      
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0005) Complementary Oligo
(CO-0005-594)
28249 1      
TIM-3 (D5D5R™) XP® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0010) Complementary Oligo
(CO-0010-647)
15231 1      
Ki-67 (8D5) Mouse mAb (SignalStar™ Conjugate 0014) Complementary Oligo
(CO-0014-750)
56398 1      
CD8ɑ (D8A8Y) Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0004) Complementary Oligo
(CO-0004-488)
45747 2      
CD68 (D4B9C) XP® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0007) Complementary Oligo
(CO-0007-594)
77318 2      
CD20 (E7B7T) XP® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0011) Complementary Oligo
(CO-0011-647)
36775 2      
Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (SignalStar™ Conjugate 0003) Complementary Oligo
(CO-0003-750)
97227 2      

9.2 故障排除和常见问题

如何验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂?

CST 彻底验证了 SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 菜单中可提供的每种抗体。通过滴定和荧光团配对以及在两轮成像中测试抗体的各种组合。对各种肿瘤和组织类型进行测试。我们还严格测试了传统显色测定法中使用的亲本抗体,因这些抗体充当这种荧光测定法的基础。

该测定法是否对冷冻组织有效?

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒与试剂用于冷冻组织。我们正处于验证我公司抗体和实验步骤用于新鲜组织或冷冻组织的流程中。

你们是否有抗小鼠抗体可提供?

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂用于小鼠组织。我们正处于验证小鼠反应性抗体的流程中。

我没在你们的可提供抗体菜单中看到我感兴趣的目标。我还能以某种方式在我的检测板中使用它吗?

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂配合我公司菜单以外的抗体使用。我们正在处于开发诸多定制解决方案以便在 SignalStar Multiplex IHC 测定法中使用您自有抗体的流程中。

我能否将此检测中使用的抗体与直接偶联物组合?

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂与直接偶联物组合使用。有可能将直接偶联物并入您的实验步骤。然而,由于 SignalStar 试剂受益于荧光信号放大,因此可能存在光谱渗出,后者因使用偶联物未放大的测定法产生。

将我的 SignalStar 染色与连续载玻片上的显色性染色比较时,我看到更多阳性细胞。我如何知道这种过度染色是否正确?

在优化期间,我们发现荧光染色可能显示比显色性染色更高的阳性%。为确保任何过度染色为特异性,请确认用其他染色剂证明亚细胞定位和共定位正确。例如,如果所有 CD8 细胞都为 CD3,则任何与显色性染色相比的 CD8过度染色很可能是正确的。

完成染色后我可能等多久才对切片成像?

对于第 1 轮成像,在完成染色后 8 小时内成像时,染色应显示稳定信号。对于第 2 轮成像,成像应尽可能接近于染色完成时进行,但是应当保持稳定长达 8 小时。

我是否需要针对自己正在使用的组织类型优化 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂?

SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂已针对抗体的荧光团配对和顺序作了优化。由于组织在靶标的质量和表达水平方面不同,将您的检验组合中抗体的浓度升高 2 倍或降低 0.5 倍可能有助在您的实验中实现最佳信号。

该测定法中应包括哪种适当的阳性对照?是否需要多个对照?

通过显色性 IHC 证明每个靶标呈阳性的任何组织都可以充当阳性对照组织。因此,每个靶标都将要求阳性对照,这有时可能导致多个对照必不可少。为了最佳比较,各切片应尽可能连续。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology、XP 和 SignalStar 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。E1L3N 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。Cy 和 CyDye 是 GE Healthcare 的注册商标。所有其他商标均属各自所有者专有。访问我们的商标信息页面。© 2023 Cell Signaling Technology, Inc. 版权所有。

发布​时间 2023 年 7 月

实验步骤编号:2965

特异性/灵敏度

CD68 (D4B9C) XP® Rabbit mAb (SignalStar Conjugate 0007) 可识别内源水平的 CD68 总蛋白。

物种反应性:

来源/纯化

通过采用重组人 CD68 蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

CD68 (巨噬唾液酸蛋白)是由单核细胞和巨噬细胞表达并且常用作其标志物的重度糖基化的跨膜蛋白 (1,2)。它存在于质膜以及内体膜和溶酶体膜上 (1-3)。据称它结合 OxLDL 并且已被观察为同型二聚体形式 (3,4)。

有限使用

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仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
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