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4735
Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody
一抗
多克隆抗体

Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody #4735

引用 (17)
筛选器:
  1. WB
  2. IHC
Western Blotting Image 1: Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody

使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody(上图)或 p53 Antibody #9282(下图),对未经处理或已经 doxorubicin(0.5 μM,36 小时)处理,已经 doxorubicin 处理后再用 λ Phosphatase NEB#P0753(10,000 单位/ml,1 小时)和 nocodazole(50 ng/ml,36 小时)处理或用 nocodazole 处理后再用 λ 磷酸酶处理的 MCF-7 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

Immunohistochemistry Image 1: Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody

使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody 对未经处理(左图)或已经 λ 磷酸酶(右图)处理的石蜡包埋的人肾癌细胞进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 2: Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody

使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody 对石蜡包埋的人肺癌细胞进行免疫组织化学分析,显示胞核定位。

Immunohistochemistry Image 3: Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody

在有对照肽(左图)或抗原特异性肽(右图)的情况下,使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody 对石蜡包埋的人结肠癌细胞进行免疫组织化学分析。

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我们的中国办事处关闭

为庆祝中国农历新年,我们的中国办事处将于2021年2月11日至2021年2月20日关闭。

感谢您的耐心等待。

支持数据

反应性 H M R
敏感性 内源性
MW (kDa) 250
来源

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫组织化学(石蜡) 1:25

保存

保存在 10mM sodium HEPES(pH 为 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物:Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 根据制造商建议说明制备 Vector® NovaRED™。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察,通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:300

特异性/敏感性

当羧基末端结构域七肽重复序列 (Tyr1, Ser2, Pro3, Thr4, Ser5, Pro6, Ser7) 在 Ser2 和 Ser5 位点被双重磷酸化以及在 Ser2 或 Ser5 位点被单磷酸化时,Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/5) Antibody 可检测内源水平的 Rpb1 。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

仓鼠 , 酿酒酵母

来源/纯化

使用与 Rpb1 CTD 七肽中 Ser2/5 周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

RNA 聚合酶 II (RNAPII) 是一个大型多蛋白复合体,可作为 DNA 依赖的 RNA 聚合酶,能够以四种核糖核苷三磷酸盐作为底物来催化 DNA 转录为 RNA (1)。最大亚基 RNAPII 亚基 B1 (Rpb1) 又称 RNAPII 亚基 A (POLR2A),包含一个唯一的七肽序列 (Tyr1, Ser2, Pro3, Thr4, Ser5, Pro6, Ser7),在蛋白的羧基末端结构域 (CTD) 中可重复多达 52 次 (1)。这个 CTD 七肽重复序列会发生多次翻译后修饰,这可决定聚合酶复合体的功能状态。在活跃转录周期中,CTD 磷酸化可通过调节染色质修饰酶和 RNA 加工蛋白募集到转录基因的过程,从而整合染色质重构和新生 RNA 加工转录 (1)。在转录起始过程中,RNAPII 有一个低磷酸化 CTD,并通过与 DNA 结合转录因子以及调节物复合体相互作用而被募集到基因启动子 (1)。RNAPII 从基因启动子上脱离需要 CDK7 磷酸化 Ser5,CDK7 是转录因子 IIH (TFIIH) 的催化亚基 (2)。除了组蛋白 H3 Lys4 甲基转移酶,Ser5 磷酸化还会介导 RNA 加帽酶的募集,从而调节转录起始和染色质结构 (3,4)。从启动子上脱离后,RNAPII 继续将基因下移到固有终止位点,从而被负向延伸因子 NELF 和 DSIF 阻滞 (5)。此时,RNAPII 不稳定并且会频繁中止转录并与基因分离。有效的转录延伸需要 CDK9 磷酸化Ser2位点,CDK9 是正向转录延伸因子 P-TEFb 的催化亚基 (6)。Ser2 磷酸化会产生一种稳定的转录延伸复合体,并促进 RNA 剪切和多聚腺苷酸化因子的募集,另外还包括可促进延伸因子相容性染色质的组蛋白 H3 Lys36 甲基转移酶的募集 (7,8)。Ser2/Ser5 磷酸化的 RNAPII 随后将全长基因转录到终止转录的 3' 端。RNAPII 从 DNA 上分离,并通过各种 CTD 磷酸酶再循环为去磷酸化形式 (1)。

除 Ser2/Ser5 磷酸化外,CTD 七肽重复序列的 Ser7 在活跃转录周期中也被磷酸化。Ser7 磷酸化是小核 (sn) RNA 基因的有效转录所必需的 (9,10)。未剪切或未被多聚腺苷酸化的 snRNA 基因在结构上与蛋白编码基因不同。与蛋白编码 RNA 中的多聚腺苷酸信号不同的是,snRNA 有一个保守的 3' 盒 RNA 加工元件,该元件能够被整合因子 snRNA 3' 端加工复合体识别 (11,12)。在转录的早期阶段,CDK7 磷酸化 Ser7 可促进 RPAP2 的募集,RPAP2 会去磷酸化 Ser5,产生可促进整合因子复合体的募集及新生 snRNA 转录物有效加工的双 Ser2/Ser7 磷酸化标记 (13-15)。

  1. Brookes, E. and Pombo, A. (2009) EMBO Rep 10, 1213-9.
  2. Komarnitsky, P. et al. (2000) Genes Dev 14, 2452-60.
  3. Ho, C.K. and Shuman, S. (1999) Mol Cell 3, 405-11.
  4. Ng, H.H. et al. (2003) Mol Cell 11, 709-19.
  5. Cheng, B. and Price, D.H. (2007) J Biol Chem 282, 21901-12.
  6. Marshall, N.F. et al. (1996) J Biol Chem 271, 27176-83.
  7. Krogan, N.J. et al. (2003) Mol Cell Biol 23, 4207-18.
  8. Proudfoot, N.J. et al. (2002) Cell 108, 501-12.
  9. Chapman, R.D. et al. (2007) Science 318, 1780-2.
  10. Egloff, S. et al. (2007) Science 318, 1777-9.
  11. Egloff, S. et al. (2008) Biochem Soc Trans 36, 590-4.
  12. Baillat, D. et al. (2005) Cell 123, 265-76.
  13. Akhtar, M.S. et al. (2009) Mol Cell 34, 387-93.
  14. Egloff, S. et al. (2010) J Biol Chem 285, 20564-9.
  15. Egloff, S. et al. (2012) Mol Cell 45, 111-22.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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