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9431
Phospho-c-Raf (Ser289/296/301) Antibody
一抗
多克隆抗体

Phospho-c-Raf (Ser289/296/301) Antibody #9431

引用 (17)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: Phospho-c-Raf (Ser289/296/301) Antibody

使用 Phospho-c-Raf (Ser289/296/301) Antibody 对未经处理的或经 TPA 处理的293 NIH/3T3 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

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支持数据

反应性 H M
敏感性 内源性
MW (kDa) 74
来源

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES(pH 为 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/敏感性

Phospho-c-Raf (Ser289/296/301) Antibody 仅当 Ser289、Ser296 或 Ser301 磷酸化后可检测内源水平的 c-Raf 蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

大鼠

来源/纯化

使用与人 c-Raf 的 Ser289/296/301 周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

A-Raf, B-Raf, c-Raf (Raf-1) 是通过 GTP 结合蛋白 Ras 所募集的主要效应因子,能激活 MEK-MAP 激酶通路 (1)。对 c-Raf 的活化了解最透彻,即涉及多个激活位点(包括 Ser338、Tyr341、Thr491、Ser494、Ser497 和 Ser499)的磷酸化 (2)。p21 激活的蛋白激酶 (PAK) 已证明可在 Ser338 位点磷酸化 c-Raf,并且 Src 家族可磷酸化 Tyr341 以诱导 c-Raf 活性 (3,4)。c-Raf 蛋白的 Ser338 位点与 A-Raf 的 Ser299 和 B-Raf 的 Ser445 相对应, 不过 B-Raf 的位点是持续性磷酸化的 (5)。c-Raf 上的抑制性 14-3-3 结合位点 Ser259 和 Ser621 可以分别由 Akt 和 AMPK 来磷酸化 (6,7)。虽然 A-Raf、B-Raf、c-Raf 的序列和功能相似,但是调节方式各不相同 (8)。值得注意的是,B-Raf 蛋白包含三个与 Akt 磷酸化共有位点(Ser364、 Ser428 和 Thr439 位点),但没有与 c-Raf Tyr341 相对应的位点 (8,9)。研究表明,B-Raf 蛋白的突变体 V600E,会导致激酶活性的升高,并且这种突变普遍存在于恶性黑色素瘤中 (10)。c-Raf 蛋白的六个位点(Ser29、Ser43、Ser289、Ser296、 Ser301 和 Ser642 位点)都过度磷酸化,这与 c-Raf 蛋白的失活相一致。这六个位点的过度磷酸化依赖于下游的 MEK 信号转导, 使得 c-Raf 对后续的激活事件无反应 (11)。

  1. Avruch, J. et al. (1994) Trends Biochem Sci 19, 279-83.
  2. Chong, H. et al. (2001) EMBO J 20, 3716-27.
  3. King, A.J. et al. (1998) Nature 396, 180-3.
  4. Fabian, J.R. et al. (1993) Mol Cell Biol 13, 7170-9.
  5. Mason, C.S. et al. (1999) EMBO J 18, 2137-48.
  6. Zimmermann, S. and Moelling, K. (1999) Science 286, 1741-4.
  7. Sprenkle, A.B. et al. (1997) FEBS Lett 403, 254-8.
  8. Marais, R. et al. (1997) J Biol Chem 272, 4378-83.
  9. Guan, K.L. et al. (2000) J Biol Chem 275, 27354-9.
  10. Davies, H. et al. (2002) Nature 417, 949-54.
  11. Dougherty, M.K. et al. (2005) Mol Cell 17, 215-24.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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