反应性 | H |
灵敏度 | 内源性 |
MW (kDa) | 95 |
来源 | 兔 |
产品信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
免疫沉淀法 | 1:50 |
为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。
注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:10
本实验步骤适用于使用蛋白 A 磁珠分离法对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤,以减少结合 Protein A Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。
重要提示:使用前,预先洗涤 #73778 磁珠:
一旦溶液变澄清,便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中,稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清,便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。
重要提示:最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
继续下述其中一项的具体步骤。
注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 产生的遮盖作用,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP 缀合物 #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)
发布时间 2008 年 12 月
修订时间 2021 年 4 月
实验步骤编号:410
人
使用与人 BAP1 的 Ser592 周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。
BAP1 (BRCA1-相关蛋白 1) 最初鉴定为一种与 BRCA1 相关的胞核定位泛素水解酶,可抑制细胞生长的 (1)。该蛋白质属于去泛素化酶的 UCH 家族,在其氨基末端区段有一个 UCH 结构域,在其羧基末端区段中有一个 BRCA1 相互作用结构域以及一个核定位信号 (1)。在肺癌和乳腺癌中已经发现 BAP1 存在频繁基因座重排、缺失和无效突变 (1,2)。对存活的肿瘤细胞系和动物肿瘤生成进行体内突变分析,结果显示去泛素酶活性和核定位信号是 BAP1 功能作为肿瘤抑制因子所必需的3。BAP1 对自身泛素化的 BRCA1/BARD1 E3 复合体没有直接的去泛素化活性 (4),但是可与 BARD1 相互作用,通过干扰复合体二聚化过程进而抑制 BRCA1/BARD1 E3 的活性 (5)。除了可与 BRCA1/BARD1 相互作用外,还已经证实 BAP1 可与 HCF-1 相互作用并使其去泛素化,从而控制其稳定性 (6)。
Cell Signaling Technology (CST) 公司使用 PhosphoScan®(该公司开发用于发现磷酸化位点7的 LC-MS/MS 平台) 鉴别 BAP1 在 Ser592 位点的磷酸化。
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