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40749
Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) Antibody
一抗
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Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) Antibody #40749

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Western Blotting Image 1: Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) Antibody

使用 Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) 抗体（上图）、ATF-2/ATF-7 (A9G1M) 兔单克隆抗体 #82870 （中间）或 β-肌动蛋白 (D6A8) 兔单克隆抗体 #8457 （下图），对未经处理 (-) 或紫外线处理 (50 MJ/cm2，20 分钟恢复；+）的 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

Western Blotting Image 2: Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) Antibody

使用 Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) 抗体（上图）、Myc-Tag (71D10) 兔单克隆抗体 #2278（中图）和 β-肌动蛋白 (D6A8) 兔单克隆抗体 #8457（下图），对转染空载 (-) 或转染带有 Myc 标签的全长人 ATF-2 蛋白 (hATF-2-Myc; +) 或 Myc 标签的全长人 ATF-7 蛋白 (hATF-7-Myc; +) 表达载体的 HeLa 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

Immunohistochemistry Image 1: Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) Antibody

使用 Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) 抗体 对未经（左图）或已经 λ 磷酸酶（右图）处理的石蜡包埋的人肺腺癌进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 2: Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) Antibody

使用 Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) 抗体 对石蜡包埋的人非小细胞肺癌进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 3: Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) Antibody

使用 Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) 抗体 对石蜡包埋且未经处理 (左图) 或已经 Anisomycin#2222 处理 (右图) 的 NIH/3T3 细胞沉淀物进行免疫组织化学分析。

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支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 65-75
来源 兔

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫组织化学（石蜡） 1:100

保存

保存在 10mM sodium HEPES（pH 为 7.5）、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育，轻晃孵育一整夜。

注意：请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测，蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa)：(#13953)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#13953，5 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）
  3. 去离子水 (dH2O)
  4. Hematoxylin（可选）
  5. 洗涤缓冲液：
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
    2. 抗体稀释剂 TBST/5% Normal Goat Serum：向 5 mL 1X TBST 中添加 250 µl Normal Goat Serum #5425)。
  6. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  7. 3% 过氧化氢：要制备，添加10 ml 30% H2O2至90 ml dH2O 中。
  8. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH2O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  9. 检测系统： VECTASTAIN® Elite ABC，包括生物素化二抗 (Vector Laboratories)。
  10. 底物：Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories)。
  11. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
  12. 封片剂： SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液，在室温下封闭 1 小时。
  6. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。4°C 温度下孵育过夜。
  7. 根据制造商建议说明制备 ABC 溶液。
  8. 清除一抗，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  9. 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗（根据制造商建议在 TBST 中进行稀释）。在室温孵育 30 分钟。
  10. 清除二抗溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  11. 按需使用 100-400 µl 预混合 ABC 溶液覆盖切片，并在湿盒中室温孵育 30 分钟。
  12. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  13. 根据制造商建议说明制备 Vector® NovaRED™。
  14. 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察，通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
  15. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  16. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  17. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
  18. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂		 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原		 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：310

特异性/敏感性

Phospho-ATF-2 (Thr69/71)/ATF-7 (Thr51/53) 抗体 仅在 Thr69 和 Thr71 双磷酸化后可检测内源水平的 ATF-2，仅在 Thr51 和 Thr53 双磷酸化时检测 ATF-7。它不能识别 Thr69 或 Thr71 单磷酸化的 ATF-2，也不能识别在 Thr51 或 Thr53 位点单磷酸化的 ATF-7。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人 ATF-2 的 Thr69 和 Thr71 周围残基相对应的合成磷酸肽，对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

转录因子 ATF-2（也被称为 CRE-BP1）结合 AP-1 和 CRE DNA 效应元件，同时也是亮氨酸拉链蛋白家族 ATF/CREB 的一员 (1)。ATF-2 与各种病毒癌蛋白以及细胞抑癌基因相互作用，并且是 SAPK/JNK 和 p38 MAP 激酶信号转导通路的靶标 (2-4)。各种细胞应激（包括基因毒剂、炎性细胞因子和紫外辐射）都能刺激 ATF-2 的转录活性。细胞应激通过在 Thr69 和 Thr71 的磷酸化激活 ATF-2 (2-4)。在体内和经 ATF-2 转染的细胞内，SAPK 和 p38 MAPK 能在这些位点磷酸化 ATF-2。这些位点的突变导致应激诱导的 ATF-2 转录缺失 (2-4)。此外，这些位点的突变会降低 E1A 和 Rb 通过ATF-2 刺激基因表达的能力 (2)。

ATF-7 是亮氨酸拉链蛋白(5) ATF/CREB 家族的另一个成员 。与之相似，Thr51 和 Thr53（分别对应 ATF-2 的 Thr69 和 Thr71）可在不同条件下被磷酸化(6, 7)。

  1. Abdel-Hafiz, H.A. et al. (1992) Mol Endocrinol 6, 2079-89.
  2. Gupta, S. et al. (1995) Science 267, 389-93.
  3. van Dam, H. et al. (1995) EMBO J 14, 1798-811.
  4. Livingstone, C. et al. (1995) EMBO J 14, 1785-97.
  5. Peters, C.S. et al. (2001) J Biol Chem 276, 13718-26.
  6. Camuzeaux, B. et al. (2008) J Mol Biol 384, 980-91.
  7. Maekawa, T. et al. (2010) EMBO J 29, 196-208.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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