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3764
Phospho-ASK1 (Ser967) Antibody
一抗
多克隆抗体

Phospho-ASK1 (Ser967) Antibody #3764

引用 (13)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: Phospho-ASK1 (Ser967) Antibody

使用 Phospho-ASK1 (Ser967) Antibody (A,B) 或 ASK1 Antibody #3762 (C,D) 对经过野生型或 Ser967Ala 突变体 ASK1 转染的 COS7 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。在蛋白质转印后 (B 和 D),通过小牛肠磷酸酶 (CIP) 处理转印膜进一步表征该抗体的磷酸化特异性。

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3764S
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支持数据

反应性 H
敏感性 转染性
MW (kDa) 155
来源

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES(pH 为 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/敏感性

Phospho-ASK1 (Ser967) Antibodyd 仅当丝氨酸 967磷酸化后可检测经转染的 ASK1。

物种反应性:

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用与人 ASK1 的丝氨酸 967周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

凋亡信号调控激酶 1 (ASK1),属于丝裂原激活蛋白激酶,在应激诱发凋亡方面发挥着重要作用 (1,2)。ASK1 在应激相关的刺激作用下,可通过不同机制被激活,进而激活 MKK4 和 MKK3,同时激活 JNK 和 p38 (3)。ASK1 过表达可激活 JNK 和 p38,并通过涉及线粒体细胞死亡通路的信号诱发几种细胞类型凋亡。来自 ASK1-/-老鼠的胚胎成纤维细胞或初级神经元细胞,对应激诱导的 JNK 和 p38 激活以及细胞死亡具有耐受性 (4,5)。Ser967 磷酸化对于 ASK1 相关 14-3-3 蛋白非常重要,可抑制细胞死亡 (6)。氧化应激可诱发 ASK1 激活环中 Ser967 去磷酸化和 Thr845 磷酸化,这两种现象均与 ASK1 活性和 ASK1 依赖型凋亡相关 (7,8)。Akt 能使 ASK1 在 Ser83 位点磷酸化,减弱 ASK1 活性,并促进细胞生存(9)。

ASK1 在 Ser967 位点磷酸化导致与14-3-3发生联系,并抑制 ASK1 激酶活性 (6)。

  1. Ichijo, H. et al. (1997) Science 275, 90-94.
  2. Wang, X.S. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 31607-31611.
  3. Matsuzawa, A. and Ichijo, H. (2001) J. Biochem. (Tokyo) 130, 1-8.
  4. Tobiume, K. et al. (2001) EMBO Rep. 2, 222-228.
  5. Nishitoh, H. et al. (2002) Genes Dev. 16, 1345-1355.
  6. Zhang, L. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8511-8515.
  7. Tobiume, K. et al. (2002) J. Cell. Physiol. 191, 95-104.
  8. Goldman, E.H. et al. (2004) J. Biol. Chem. in press, .
  9. Kim, A.H. et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21, 893-901.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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