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2225
Caspase-1 Antibody
一抗
多克隆抗体
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Caspase-1 Antibody #2225

引用 (92)
筛选器：
  1. WB
Western Blotting Image 1: Caspase-1 Antibody

使用 Caspase-1 Antibody，对来自 THP-1 细胞和 HL-60 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

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支持数据

反应性 H
敏感性 内源性
MW (kDa) 20p20.30 至 45 β、δ、γ、50α。
来源 兔

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES（pH 为 7.5）、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育，同时轻轻晃动。

注意：请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液：含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa)：(#13953)。
  13. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#13953，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）一起孵育，并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后，再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：263

特异性/敏感性

Caspase-1 Antibody 可检测Caspase-1 原的内源水平和Caspase-1 p20 亚基的内源水平。预期该抗体可检测 α、β、γ 和 δ 同工型。

物种反应性：

人

来源/纯化

通过采用与人Caspase-1 的 p20 亚基内部的残基相对应的合成肽，对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

Caspase-1 或白介素-1ß 转化酶 (ICE/ICEα) 是一种 I 类半胱氨酸蛋白酶，还包括 caspase-4、-5、-11 和 -12。Caspase-1 能够将炎症细胞因子（如 pro-IL-1ß 和干扰素-γ 诱导因子 (IL-18)）裂解成成熟蛋白 (1,2)。与其他半胱天冬酶一样，caspase-1 通过酶原蛋白水解被激活，产生一个由两个活性亚基 （p20 和 p10）组成的四聚体。Caspase-1 具有巨大的氨基末端前体域，此区域包含一个半胱天冬酶募集区域 (CARD)。Caspase-1 过表达会诱导细胞凋亡 (3)。Caspase-1 缺失小鼠在凋亡方面没有严重缺陷，但在 pro-IL-1β 蛋白的成熟过程中有缺陷，而且这类小鼠可抵抗内毒素休克 (4,5)。研究发现，caspase-1 至少有六种同工型，其中包括 caspase-1 α、β、γ、δ、ε 和 ζ (6)。多数 caspase-1 同工型（α、β、γ 和 δ）生成的产物在 30-48 kDa 之间，并通过过表达诱导细胞凋亡。Caspase-1 ε 通常只包含 p10 亚基，不会诱导细胞凋亡，可作为一种显性失活蛋白。Caspase-1 中广泛表达的 ζ 同工型会诱导细胞凋亡，并且与 α 同工型相比，缺乏 39 个氨基末端残基 (6)。caspase-1 通过一个称为“炎症小体”的寡聚化分子平台激活，此中包含 caspase-5、Pycard/Asc 和 NALP1 (7)。

  1. Thornberry, N.A. et al. (1992) Nature 356, 768-74.
  2. Martinon, F. and Tschopp, J. (2004) Cell 117, 561-74.
  3. Miura, M. et al. (1993) Cell 75, 653-60.
  4. Kuida, K. et al. (1995) Science 267, 2000-3.
  5. Li, P. et al. (1995) Cell 80, 401-11.
  6. Feng, Q. et al. (2004) Genomics 84, 587-91.
  7. Martinon, F. et al. (2002) Mol Cell 10, 417-26.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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