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15011
Atg2A Antibody
一抗
多克隆抗体

Atg2A Antibody #15011

引用 (4)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: Atg2A Antibody

使用 Atg2A Antibody ,对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

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15011S
100 µl

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支持数据

反应性 H
敏感性 内源性
MW (kDa) 213
来源

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES(pH 为 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:263

特异性/敏感性

Atg2A Antibody 可检测 Atg2A 总蛋白的内源水平。

物种反应性:

来源/纯化

使用与人类 Atg2A 蛋白 Glu750 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

自噬是导致自噬体和溶酶体内部大量胞质内容物降解的分解代谢过程。自噬的对照涉及一组最初具有酵母表征的自噬相关基因 (Atg) 编码的蛋白质 (1)。酵母中的探索研究表明,Atg2 对于通过与 Atg18 相互作用而自噬和逆向转运 Atg9 是必需的 (2-6)。两种人类 Atg2 同源物(Atg2A、Atg2B)对自噬体形成至关重要,因为二者的沉默会导致未闭合的自噬性结构堆积 (7)。饥饿诱导的自噬过程会将 Atg2A 靶定至自噬体生物生成的起始部位,其中它会与 DFCP1、WIPI-1 和其他自噬相关蛋白结合 (8)。

Atg2 蛋白还在脂质小滴代谢中发挥作用,因为 Atg2A 和 AtgB 的损耗会导致脂质小滴的大小、数目和分布的改变 (7,8)。在 Atg5缺失的细胞中未观察到脂质小滴的这些形态变化,这表明该功能与 Atg2 在自噬中的作用无关 (7)。饥饿诱导的自噬过程将 Atg2A(连同 Atg14L 一起)定位至富含 PI3P 的早期自噬体膜,同时将 Atg2A 和 Atg14L 的另一个亚群定位至与自噬状态无关脂质小滴 (8)。根据依托泊苷和多柔比星诱导的凋亡期间 Atg2A 表达的增加表明,Atg2A 可充当拓扑异构酶 II 抑制剂介导的凋亡的有用的指标(9)。相应 Atg2B 基因中的突变与微卫星不稳性高的胃癌和结直肠癌相关 (10)。

  1. Reggiori, F. and Klionsky, D.J. (2002) Eukaryot Cell 1, 11-21.
  2. Shintani, T. et al. (2001) J Biol Chem 276, 30452-60.
  3. Wang, C.W. et al. (2001) J Biol Chem 276, 30442-51.
  4. Suzuki, K. et al. (2001) EMBO J 20, 5971-81.
  5. Obara, K. et al. (2008) J Biol Chem 283, 23972-80.
  6. Reggiori, F. et al. (2004) Dev Cell 6, 79-90.
  7. Velikkakath, A.K. et al. (2012) Mol Biol Cell 23, 896-909.
  8. Pfisterer, S.G. et al. (2014) J Lipid Res 55, 1267-78.
  9. Kusama, Y. et al. (2009) Apoptosis 14, 1165-75.
  10. Kang, M.R. et al. (2009) J Pathol 217, 702-6.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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