SignalStain^® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit #12692

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

1. 二甲苯。
2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. Hematoxylin（可选）。

5. 洗涤缓冲液。

   注意： 洗涤将需要额外的 10X TBST。

   1. 含 Tween^® 20 (TBST-10X) #9997盐缓冲液：要制备洗涤缓冲液，添加 100 µl 含 Tween^® 20 (TBST-10X) (#9997) 的 Tris 盐缓冲液至 900 ml 的 dH₂O 中。或
   2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：要制备 1 L 溶液，添加 24.2 g Trizma^® 碱 (C₄H₁₁NO₃) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 至 1 L dH₂O。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。1X TBS/0.1% Tween^® 20 (1X TBST)：要制备 1 L 溶液，添加 100 ml 10X TBS 至 900 ml dH₂O。添加 1 ml Tween^® 20 并混合。
6. 抗体稀释液： SignalStain^® 抗体稀释液 (#8112)
7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH₂O 中。
8. 3% 过氧化氢：要制备溶液，添加10 ml 30% H₂O₂至90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备4 mL 的 dH₂O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
10. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC 检测试剂 (HRP, Rabbit #8114)。
11. 底物：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)，其中包含 SignalStain^® DAB Diluent (#11724) 和 SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate (#11725)。
12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
13. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

1. 对于柠檬酸：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 (95°-98°C)10分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 在每个切片上滴加 100–200 µl 首选封闭液，在室温下封闭 1 小时。
6. 擦去封闭液，并给每块切片添加 100-200 µl 以 1:500在 SignalStain ^®Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
   1. Rabbit (DA1E) mAb XP^® SignalStain^® Isotype Control (#3900) 被用作阴性对照。以 1:500 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 中稀释并在每张切片上加100-200 µl。
7. 将 SignalStain^® Boost 检测试剂 (#8114) 平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，在洗涤缓冲液中清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 根据需要，滴入 1-3 滴 SignalStain^® Boost 检测试剂 (#8114) 覆盖切片。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 加入 30 µl SignalStain^® DAB 色源浓缩剂 (#11725) 至 1 ml SignalStain^® DAB Diluent (#11724) 中，并且使用前需充分混合。
12. 在每张切片上加 100–400 µl SignalStain^® DAB 并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
13. 将切片浸入 dH₂O 中。
14. 如果需要，使用 hematoxylin (14166#) 复染切片。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 脱水环节：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 使用盖玻片和封片剂 (14177#) 封片。