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12692
SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit
一抗
IHC 试剂盒

SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit #12692

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Immunohistochemistry Image 1: SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit

使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (D3E9) Rabbit mAb #9579(左)或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® SignalStain® Isotype Control #12960(右)对石蜡包埋的 E14 小鼠胚胎进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 2: SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit

使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (D3E9) Rabbit mAb #9579 (左)或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® SignalStain® Isotype Control #12960(右)对石蜡包埋的 Kelly 异种移植物进行免疫组织化学分析。

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12692S
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实验步骤

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免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. Hematoxylin(可选)。
  5. 洗涤缓冲液

    注意: 洗涤将需要额外的 10X TBST。

    1. 含 Tween® 20 (TBST-10X) #9997盐缓冲液:要制备洗涤缓冲液,添加 100 µl 含 Tween® 20 (TBST-10X) (#9997) 的 Tris 盐缓冲液至 900 ml 的 dH2O 中。或
    2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS):要制备 1 L 溶液,添加 24.2 g Trizma® 碱 (C4H11NO3) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 至 1 L dH2O。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。1X TBS/0.1% Tween® 20 (1X TBST):要制备 1 L 溶液,添加 100 ml 10X TBS 至 900 ml dH2O。添加 1 ml Tween® 20 并混合。
  6. 抗体稀释液: SignalStain® 抗体稀释液 (#8112)
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢:要制备溶液,添加10 ml 30% H2O2至90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备4 mL 的 dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC 检测试剂 (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059),其中包含 SignalStain® DAB Diluent (#11724) 和 SignalStain® DAB Chromogen Concentrate (#11725)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

  1. 对于柠檬酸:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 (95°-98°C)10分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 在每个切片上滴加 100–200 µl 首选封闭液,在室温下封闭 1 小时。
  6. 擦去封闭液,并给每块切片添加 100-200 µl 以 1:500在 SignalStain ®Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
    1. Rabbit (DA1E) mAb XP® SignalStain® Isotype Control (#3900) 被用作阴性对照。以 1:500 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释并在每张切片上加100-200 µl。
  7. 将 SignalStain® Boost 检测试剂 (#8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,在洗涤缓冲液中清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要,滴入 1-3 滴 SignalStain® Boost 检测试剂 (#8114) 覆盖切片。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 30 µl SignalStain® DAB 色源浓缩剂 (#11725) 至 1 ml SignalStain® DAB Diluent (#11724) 中,并且使用前需充分混合。
  12. 在每张切片上加 100–400 µl SignalStain® DAB 并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (14166#) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 脱水环节
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (14177#) 封片。

发布​于 2013 年 7 月 

修订于 2016 年 6 月

实验步骤编号:64

产品说明

SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit 可检测在福尔马林固定、石蜡包埋的人和小鼠组织样本的活化的 caspase-3。Cleaved Caspase-3 (Asp175) (D3E9) Rabbit mAb 由基于多聚物的 HRP 偶联的 SignalStain® Boost IHC 检测试剂结合 SignalStain® DAB Diluent 和色源浓缩剂进行检测。此外还包含浓度匹配的兔单克隆 IgG 对照来验证染色的特异性。

这些试剂的组合提供一个灵敏和特异的方法来检测组织样本中凋亡现象。

特异性/敏感性

SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit 可检测从临近 Asp175 处剪切的活化 caspase-3 大片段(17/19 kDa) 的内源水平。该抗体无法检测全长 caspase-3 或其他剪切的半胱天冬酶。该试剂盒开发用于且推荐用于免疫组织化学。

物种反应性:

人, 小鼠

来源/纯化

使用人 caspase-3 蛋白 Asp175 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (D3E9) Rabbit mAb。Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® SignalStain® Isotype Control 不针对任何已知的抗原。它可用作兔源 IgG 单克隆抗体的同型对照。

背景

Caspase-3 (CPP-32, Apoptain, Yama, SCA-1) 是一个凋亡的关键执行者,因为它对许多关键的蛋白起着部分或全部的裂解作用,比如核酶多聚 (ADP-ribose) 聚合酶 (PARP) (1)。caspase-3 的激活需要经过其未活化的酶原形式转变为活化的 p17 和 p12 片段的蛋白水解过程。caspase-3 的剪切需要位于 P1 位点的天门冬氨酸残基 (2)。

  1. Fernandes-Alnemri, T. et al. (1994) J Biol Chem 269, 30761-4.
  2. Nicholson, D. W. et al. (1995) Nature 376, 37-43.

通路和蛋白

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