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3666
Annexin A7 Antibody
一抗
多克隆抗体
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Annexin A7 Antibody #3666

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Western Blotting Image 1: Annexin A7 Antibody

使用 Annexin A7 Antibody 对 U251、SHSY-5Y 和 COS 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

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3666S		 100 µl

定制制剂

支持数据

反应性 H Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 47, 51
来源 兔

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES（pH 为 7.5）、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育，轻晃孵育一整夜。

注意：请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测，蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

特异性/敏感性

Annexin A7 Antibody 可检测总膜联蛋白 A7（包括同工型 1 和 2）的内源水平。

物种反应性：

人, 猴

来源/纯化

使用与人膜联蛋白 A7 羧基末端附近残基相对应的合成肽，对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白 A 和肽亲和力色谱对抗体进行纯化。

背景

膜联蛋白 A7/ANXA7 是钙/磷脂结合蛋白膜联蛋白家族的一员，与膜融合与胞外分泌过程有关 (1)。膜联蛋白 A7 是一种 GTP 酶，GTP 结合与 PKC 活性均对调节蛋白功能非常重要 (2,3)。膜联蛋白 A7 与膜的结合以一种钙依赖性方式进行 (4)。选择性剪切会产生两种同工型。经证明膜联蛋白 A7 的亚细胞定位存在于细胞浆、囊泡结构、膜和肾上腺嗜铬颗粒 (5,6)。研究表明，胞核定位存在于发育性小鼠中枢神经系统和成年小鼠脑中 (7)。膜联蛋白 A7 缺陷型小鼠的研究表明，此蛋白在胰岛素分泌、钙离子信号转导 (8) 以及心脏细胞内钙稳态电稳定性 (9) 方面发挥作用。膜联蛋白 A7 基因可能是一种抑癌基因 (10)，据报道膜联蛋白 A7 基因在前列腺癌中的拷贝数会发生改变 (11)。膜联蛋白 A7 表达还与人恶性胶质瘤患者的存活率有关 (12)，小鼠单倍型不足会导致基因不稳定，从而诱导肿瘤发生 (13)。

  1. Pollard, H.B. et al. (1990) J Membr Biol 117, 101-12.
  2. Caohuy, H. and Pollard, H.B. (2002) J Biol Chem 277, 25217-25.
  3. Caohuy, H. et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 10797-802.
  4. Chander, A. et al. (2003) Cell Calcium 33, 11-7.
  5. Selbert, S. et al. (1995) J Cell Sci 108 ( Pt 1), 85-95.
  6. Clemen, C.S. et al. (2001) Neuroreport 12, 1139-44.
  7. Rick, M. et al. (2005) BMC Neurosci 6, 25.
  8. Srivastava, M. et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 13783-8.
  9. Schrickel, J.W. et al. (2007) Cardiovasc Res 76, 257-68.
  10. Srivastava, M. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 4575-80.
  11. Dong, J.T. (2006) J Cell Biochem 97, 433-47.
  12. Hung, K.S. and Howng, S.L. (2003) J Neurosurg 99, 886-92.
  13. Srivastava, M. et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 14287-92.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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