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43910
ACTL6/BAF53 Antibody
一抗
多克隆抗体

ACTL6/BAF53 Antibody #43910

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筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: ACTL6/BAF53 Antibody

使用 ACTL6/BAF53 Antibody 对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

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43910S
100 µl

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支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 47
来源

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES(pH 为 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:263

特异性/敏感性

ACTL6/BAF53 Antibody 可检测 ACTL6/BAF53 总蛋白的内源水平。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人 ACTL6 蛋白中 Val23 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

调节染色质结构是调控转录激活和抑制的必要部分。可以通过至少两个进化上保守的策略,即通过 ATP-依赖性染色质重塑蛋白破坏组蛋白-DNA 接触或通过组蛋白尾修饰(包括甲基化和乙酰化),来进行修饰。四类 ATP-依赖性组蛋白重塑蛋白之一为 SWI/SNF 复合体,其核心催化亚基是 Brg1 或高度相关的蛋白质 hBRM (1)。这种 SWI/SNF 复合体含有不同的亚基,但其与 Brg1 或 hBRM 的结合是恒定的 (1)。据已表明,SWI/SNF 复合体可调控基因激活、细胞生长、细胞周期和分化 (1)。据已表明,Brg1/hBRM 可通过增强糖皮质激素受体的转录激活来调控转录 (2)。尽管通常与转录激活相关,但还发现 Brg1/hBRM 存在于与转录抑制相关的复合体中,包括 HDACs、Rb 和 Tif1β (3-5)。Brg1/hBRM 在哺乳动物早期胚胎发生期间对调控基因转录起着至关重要的作用。此外,Brg1/hBRM 还作为抑癌基因起到作用,并且 Brg1 会在多种肿瘤细胞系中发生突变 (6-8)。

ACTL6/BAF53 蛋白是高度同源的肌动蛋白相关蛋白,可见于 SWI/SNF 复合体 (9)。除了典型的 SWI/SNF 复合体外,ACT6LA/BAF53a 还是胚胎 SWI/SNF 复合体(称为 esBAF)的一员,它在多能性和发育方面起到作用 (10-12)。ACTL6B/BAF53b 是神经特异性 SWI/SNF 复合体的一员,可促进结合靶基因,并且与记忆和突触可塑性有关 (13-15)。ACTL6/BAF53 经证实会与 c-Myc 相互作用,并在其中作为辅因子发挥作用,在转换过程中非常重要 (16)。进一步研究表明,ACTL6/BAF53 与各种癌细胞中的 EMT 和转化有关 (17,18)。

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  2. Trotter, K.W. and Archer, T.K. (2007) Mol Cell Endocrinol 265-266, 162-7.
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  5. Underhill, C. et al. (2000) J Biol Chem 275, 40463-70.
  6. Magnani, L. and Cabot, R.A. (2009) Reproduction 137, 23-33.
  7. Medina, P.P. et al. (2008) Epigenetics 3, 64-8.
  8. Medina, P.P. et al. (2008) Hum Mutat 29, 617-22.
  9. Zhao, K. et al. (1998) Cell 95, 625-36.
  10. Ho, L. et al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106, 5181-6.
  11. Krasteva, V. et al. (2012) Blood 120, 4720-32.
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  17. Saladi, S.V. et al. (2017) Cancer Cell 31, 35-49.
  18. Sun, W. et al. (2017) Oncol Rep 37, 2405-17.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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