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28572
Human T Cell Th1 Cytokine Response Flow Cytometry Panel
流式细胞术试剂盒与试剂
检测试剂盒

Human T Cell Th1 Cytokine Response Flow Cytometry Panel #28572

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Flow Cytometry Image 1: Human T Cell Th1 Cytokine Response Flow Cytometry Panel
与浓度匹配的 Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (PE Conjugate) #63630(虚线)比较,使用 CD3 (UCHT1) Mouse mAb (PE Conjugate)(实线)对活的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。
Flow Cytometry Image 2: Human T Cell Th1 Cytokine Response Flow Cytometry Panel
与浓度匹配的 Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (violetFluor 450 Conjugate) #40282(虚线)比较,使用 CD4 (RPA-T4) Mouse mAb (violetFluor 450 Conjugate)(实线)对活的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。
Flow Cytometry Image 3: Human T Cell Th1 Cytokine Response Flow Cytometry Panel
与浓度匹配的 Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (PE-Cy7® Conjugate) #79339(虚线)比较,使用 CD8α (RPA-T8) Mouse mAb (PE-Cy7® Conjugate)(实线)对活的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。
Flow Cytometry Image 4: Human T Cell Th1 Cytokine Response Flow Cytometry Panel
使用 TNF-α (D1G2) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)(顶行)或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #2985(底行)并用 CD3 (UCHT1) Mouse mAb (FITC Conjugate) #86774共染色,对未经处理的(左栏)或经过 TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetate) #4174(40 nM,4小时)、Ionomycin, Calcium Salt #9995(2 μM,4 小时)和 Brefeldin A #9972(1 μg/ml,最后 3 小时的处理)(右栏)处理的人外周血淋巴细胞进行流式细胞分析。
Flow Cytometry Image 5: Human T Cell Th1 Cytokine Response Flow Cytometry Panel
使用 IFN-γ (D3H2) XP® 兔单克隆抗体 (Alexa Fluor® 488 Conjugate)(顶行)或浓度匹配的兔 (DA1E) 单克隆抗体 IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 488Conjugate) #2975(底行),对未经处理的(左栏)或经 TPA #4174(40 nM,4 小时)、Ionomycin #9995(2 μM,4 小时)和 Brefeldin A #9972(1 μg/mL,最后 3 小时刺激)(右栏)处理的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。将细胞用 #19881 CD3 (UCHT1) Mouse mAb (APC Conjugate) 共染色。
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28572S
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重要订购明细

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实验步骤

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直接偶联抗体的流式细胞术 Triton™ X-100 透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂均可与我公司的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton™ X-100) #51995 一并高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):要配制 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746)
  3. 细胞透化缓冲液:购买即用型 (#39487) ,或要配制 10 ml,请添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 抗体稀释液。4°C 保存。
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释液 (#13616),或要配制 100 ml,请在 100 ml 1X PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998)。4°C 保存。

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定与透化

:固定前,贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

:如果使用全血,则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

:如果表位遭甲醛和/或 Triton™ X-100 破坏,则可在固定前添加靶向 CD 标志物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。
  5. 在每一百万个细胞约 100 μl 细胞透化缓冲液中重悬细胞。
  6. 在室温孵育 10 分钟。
  7. 继续进行染色或将细胞在 PBS 中 -4°C 保存过夜。

C. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次检测用 5x105 至 1x106 个细胞)。
  2. 将细胞离心,弃去清液。
  3. 在 100 µl 稀释的抗体偶联物中重悬细胞,抗体偶联物在抗体稀释缓冲液中按建议的或如通过滴定确定的稀释度配制。
  4. 室温 (20-25°C) 孵育 1 小时。避光。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 1X PBS 中重悬细胞,在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2017 年 1 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:1344

产品说明

Human T Cell Th1 Cytokine Response Flow Cytometry Panel 可用于观察标志性 Th1 细胞因子(包括 IFN-γ 和 TNF-α)的产生情况。

T 细胞依据 CD3 的表达来鉴定。常规的 T 细胞有两个主要亚群:表达 CD4 的辅助性 T 细胞和表达 CD8 的细胞毒性 T 细胞。Th1 细胞是辅助性 T 细胞亚群的几个亚群之一。Th1 细胞促进细胞介导的免疫,以对抗病毒性感染、胞内细菌和肿瘤细胞。Th1 和细胞毒性 T 细胞均可以产生 IFN-γ 和 TNF-α。

产品使用信息

可以通过多种方法使细胞活化来诱导 T 细胞产生细胞因子。这些方法包括通过与激动剂 CD3 抗体(如人 CD3ε 活化性 (OKT3) 小鼠 mAb(低内毒素,无叠氮化物))孵育,从而通过 T 细胞受体进行刺激,或用 PMA (佛波醇12-十四酸酯13-乙酸)和离子霉素的组合处理。细胞刺激期间添加布雷非德菌素 A 和莫能菌素将限制细胞因子分泌并促进检测胞内细胞因子。该试剂盒中的所有抗体均与直接偶联抗体的流式细胞术 TritonTM X-100 透化实验步骤兼容,可在单一染色混合物中用于固定和透化的细胞。在固定和抗体孵育之前,我们建议添加可固定的活力指示染料(例如 Ghost Dye™ Violet 510 Viability Dye),以便鉴定死细胞并从分析中排除之。

观察 T 细胞中 Th1 细胞因子产生情况的门控策略:
如果使用了可固定的活力指示染料,则首先对活细胞设门。接下来,基于前向散射和侧向散射对淋巴细胞设门。要观察辅助 T 细胞的细胞因子产生情况,请对淋巴细胞门内部的 CD3+CD4+ 细胞设门,然后鉴定该门内部呈 IFN-γ 和/或 TNF-α 染色阳性的细胞。要观察细胞毒性 T 细胞的细胞因子产生情况,请对淋巴细胞门内部的 CD3+CD8+ 细胞设门,然后鉴定该门内部呈 IFN-γ 和/或 TNF-α 染色阳性的细胞。

保存

CD3 (UCHT1) Mouse mAb (PE Conjugate)、CD4 (RPA-T4) Mouse mAb (violetFluor™ 450 Conjugate) 和 CD8α (RPA-T8) Mouse mAb (PE-Cy7® Conjugate) 在 10 mM NaH2PO4、150 mM NaCl、0.09% NaN3、0.1% 明胶(pH7.2)中供应。TNF-α (D1G2) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 和 IFN-γ (D3H2) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 在 PBS(pH 7.2)、小于 0.1% 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中供应。储存于 4oC。切勿分装抗体,避光保存,切勿冷冻。

在推荐温度保存时,该试剂盒中的所有组分均随外包装标签上印刷的日期保持稳定。请参阅产品标签、说明书或网页,以了解每个单独组分的特定“最佳使用日期”。

特异性/灵敏度

Human T Cell Th1 Cytokine Response Flow Cytometry Panel 中的每种抗体均可检测其内源水平的靶蛋白。CD3 (UCHT1) Mouse mAb (PE Conjugate) 可识别 CD3ε。CD3 (UCHT1) Mouse mAb (PE Conjugate)、CD4 (RPA-T4) Mouse mAb (violetFluor™ 450 Conjugate) 和 CD8α (RPA-T8) Mouse mAb (PE-Cy7® Conjugate) 可检测胞外结构域内的表位。TNF-α (D1G2) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 和 IFN-γ (D3H2) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 可检测胞内结构域内的表位。

物种反应性:

来源/纯化

通过亲和层析从组织培养上清液中纯化单克隆抗体。纯化的抗体在最佳条件下偶联,未反应的染料从制剂中去除。

限制使用

除非 CST 的合法授书代表以书面形式书行明确同意,否书以下条款适用于 CST、其关书方或分书商提供的书品。 任何书充本条款或与本条款不同的客书条款和条件,除非书 CST 的合法授书代表以书面形式书独接受, 否书均被拒书,并且无效。

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仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
Cy 和 CyDye 是 GE Healthcare 的注册商标。
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