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69210
Human Monocyte STING Activation Flow Cytometry Panel
流式细胞术试剂盒与试剂
检测试剂盒

Human Monocyte STING Activation Flow Cytometry Panel #69210

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Flow Cytometry Image 1: Human Monocyte STING Activation Flow Cytometry Panel
对未处理(顶行)的或经 2',3'-cGAMP(钠盐)#35573(10 μg/mL,3 小时;底行)转染且用 Human Monocyte STING Activation Flow Cytometry Panel 染色的固定/透化的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。根据产品使用信息对细胞设门,同时最终直方图显示未处理(蓝色)的或转染(绿色)的经典单核细胞群。
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69210S
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实验步骤

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直接偶联抗体的流式细胞术 Triton™ X-100 透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂均可与我公司的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton™ X-100) #51995 一并高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):要配制 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746)
  3. 细胞透化缓冲液:购买即用型 (#39487) ,或要配制 10 ml,请添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 抗体稀释液。4°C 保存。
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释液 (#13616),或要配制 100 ml,请在 100 ml 1X PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998)。4°C 保存。

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定与透化

:固定前,贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

:如果使用全血,则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

:如果表位遭甲醛和/或 Triton™ X-100 破坏,则可在固定前添加靶向 CD 标志物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。
  5. 在每一百万个细胞约 100 μl 细胞透化缓冲液中重悬细胞。
  6. 在室温孵育 10 分钟。
  7. 继续进行染色或将细胞在 PBS 中 -4°C 保存过夜。

C. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次检测用 5x105 至 1x106 个细胞)。
  2. 将细胞离心,弃去清液。
  3. 在 100 µl 稀释的抗体偶联物中重悬细胞,抗体偶联物在抗体稀释缓冲液中按建议的或如通过滴定确定的稀释度配制。
  4. 室温 (20-25°C) 孵育 1 小时。避光。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 1X PBS 中重悬细胞,在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2017 年 1 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:1344

产品说明

Human Monocyte STING Activation Flow Cytometry Panel 包括靶向磷酰-STING (Ser366) 的抗体和表型标记物,以实现在外周血单核细胞 (PBMC) 当中观察人单核细胞群内的 STING 激活。

CD45 是一种泛白细胞标记物。通过 CD11b 和 HLA-DR 的共表达鉴定单核细胞和树状细胞 (DC) 。单核细胞可以依据 CD14 的表达与 DC 区分。经典单核细胞为 CD14+CD16-,过渡单核细胞为 CD14+CD16+,并且非经典单核细胞为 CD14dimCD16+。DC 为 CD14-CD16-。STING 介导对 DNA 的天然免疫应答。一旦结合 cGAS 产生的第二信使 cGAMP,则 STING 激活。cGAMP 与 cGAS 的结合在 STING 中触发构象变化,将 STING 从 ER 运输到 Golgi,并召集 TBK1,后者使 STING 在 Ser366 磷酸化。

产品使用信息

可以通过用多种 STING 激动剂处理,诱导 STING 激活,这些激动剂包括 Poly(dA:dT) Sodium Salt #47945 和第二信使 2',3'-cGAMP(钠盐)#35573。该试剂盒中的所有抗体均兼容于 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton X-100) #51995,并可在单一染色混合物中对固定和透化的细胞使用。在固定和抗体孵育之前,我们建议添加可固定的活力染料(例如 Ghost Dye Violet 510 Fixable Viability Dye #59863),以实现辨识死细胞并将其从分析中排除。

关于各产品稀释比例,请参阅组合产品数据表或各产品页面。

观察单核细胞群中 STING 磷酸化的设门策略: 如果使用了可固定的活力指示染料,则首先对活细胞设门。接下来,对 CD45+ 免疫细胞设门。查看 CD45+ 细胞群,使用适当的散射参数(如 FSC-A 与 FSC-H)对单重态设门。对 CD11b+HLA-DR+ 单核细胞和 DC 上观察 CD11b 与 HLA-DR 表达并且对其设门。在设门的群体中观察 CD14 与 CD16。经典单核细胞为 CD14+CD16-,过渡单核细胞为 CD14+CD16+,非经典单核细胞为 CD14dimCD16+,并且 DC 为 CD14-CD16-。单核细胞 MDSC 为 CD11b+HLA-DR-CD14+,并且也可以观察到。在目标群体中观察磷酰-STING (Ser366)。

保存

CD45 (HI30) Mouse mAb (violetFluor 450 Conjugate)、CD11b/ITGAM (M1/70) Rat mAb (FITC Conjugate)、HLA-DR (L243) Mouse mAb (PerCP Conjugate)、CD14 (61D3) Mouse mAb (redFluor 710 Conjugate) 和 CD16 (3G8) Mouse mAb (PE Conjugate) 在 10 mM NaH2PO4、150 mM NaCl、0.09% NaN3、0.1% 明胶(pH 值为 7.2)中供应。Phospho-STING (Ser366) (D8K6H) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 在 PBS(pH 值为 7.2)、低于 0.1% 的叠氮化钠和 2 mg/mL BSA 中供应。储存于 4oC。切勿分装抗体,避光保存,切勿冷冻。

在推荐温度保存时,该试剂盒中的所有组分均随外包装标签上印刷的日期保持稳定。请参阅产品标签、数据表或网页,以了解每个单独组分具体的“最佳使用日期”。

特异性/灵敏度

Human Monocyte STING Activation Flow Cytometry Panel 中的每种抗体均可检测其内源水平的靶标蛋白。CD45 (HI30) Mouse mAb (violetFluor 450 Conjugate)、CD11b/ITGAM (M1/70) Rat mAb (FITC Conjugate)、HLA-DR (L243) Mouse mAb (PerCP Conjugate)、CD14 (61D3) Mouse mAb (redFluor 710 Conjugate) 和 CD16 (3G8) Mouse mAb (PE Conjugate) 可检测细胞外结构域内部的表位。仅当 STING 蛋白在 Ser366 位点被磷酸化时,Phospho-STING (Ser366) (D8K6H) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 才可检测 STING 蛋白的内源水平。

物种反应性:

来源/纯化

通过亲和层析从组织培养上清液中纯化单克隆抗体。纯化的抗体在最佳条件下偶联,未反应的染料从制剂中去除。

限制使用

除非 CST 的合法授书代表以书面形式书行明确同意,否书以下条款适用于 CST、其关书方或分书商提供的书品。 任何书充本条款或与本条款不同的客书条款和条件,除非书 CST 的合法授书代表以书面形式书独接受, 否书均被拒书,并且无效。

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