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31328
Human B Cell Signaling Flow Cytometry Panel
流式细胞术试剂盒与试剂
检测试剂盒

Human B Cell Signaling Flow Cytometry Panel #31328

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Flow Cytometry Image 1: Human B Cell Signaling Flow Cytometry Panel
对经过抗人 IgM(20μg/mL,5 分钟;顶行)处理或未经处理(底行)以及用 Human B Cell Signaling Flow Cytometry Panel 染色的固定/通透的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。
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31328S
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重要订购明细

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实验步骤

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流式细胞术,针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):若要制备 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

:固定前,贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

:如果使用全血,则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者,细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时,向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度,使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离,以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温孵育 1 小时。避光。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2009 年 7 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:407

产品说明

Human B Cell Signaling Flow Cytometry Panel 可用于检测外周血单核细胞 (PBMC) 中人 B 细胞的激活。

CD45 是一种泛白细胞标记物。可通过 CD19 表达来识别 B 细胞。B 细胞受体 (BCR) 的参与会触发 CD79A 在 Tyr182 位点的酪氨酸磷酸化,这是由 Src 家族激酶介导的。BCR 参与后,Syk 被招募到 BCR 信号转导复合体内的磷酸化 ITAM 基序,该复合体可通过激酶激活环内的 Tyr525/526 磷酸化来促进 Syk 激活。

产品使用信息

使用 Goat Anti-Human IgM, F(ab')2 Antibody (Low Endotoxin, Azide-free) #96232 进行处理。可诱导 B 细胞受体激活。该试剂盒中的所有抗体均与 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 兼容,并可在单一染色混合物中对固定和通透的细胞使用。在固定和抗体孵育之前,我们建议添加可固定的活力染料(例如 Ghost Dye Violet 510 Fixable Viability Dye #59863),以实现辨识死细胞并将其从分析中排除。

关于各产品稀释比例,请参阅组合产品数据表或各产品页面。

观察 B 细胞群中 B 细胞受体激活的门控策略:对未经处理和经过处理的细胞群应用相同的门控策略。如果使用了可固定的活性染料,则首先对活性细胞进行门控。接下来,对 CD45+ 免疫细胞设门。查看 CD45+ 细胞群,使用适当的散射参数(如 FSC-A 与 FSC-H)对单重态设门。观察 CD19 与 SSC-A 以及 CD19+ B 细胞上的门控。观察 CD19+ 门控内的磷酸化 CD79A (Tyr182) 和磷酸化 Syk (Tyr525/526)。

保存

CD45 (HI30) Mouse mAb (violetFluor 450 Conjugate) 保存在 10 mM NaH2PO4、150 mM NaCl、0.09% NaN3、0.1% 明胶(pH 值为 7.2)中。CD19 (Intracellular Domain) (D4V4B) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)、Phospho-CD79A (Tyr182) (D1B9) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 和 Phospho-Syk (Tyr525/526) (C87C1) Rabbit mAb (PE Conjugate) 保存在 PBS(pH 值为 7.2)、小于 0.1% 的叠氮化钠和 2 mg/mL BSA 中。保存在 4ºC 下。切勿分装抗体,避光保存,切勿冷冻。

在推荐温度保存时,该试剂盒中的所有组分均随外包装标签上印刷的日期保持稳定。请参阅产品标签、数据表或网页,以了解每个单独组分具体的“最佳使用日期”。

特异性/灵敏度

Human B Cell Signaling Flow Cytometry Panel 的每种抗体均可检测其靶标蛋白的内源水平。CD45 (HI30) Mouse mAb (violetFluor 450 Conjugate) 可检测胞外结构域内的表位。CD19 (Intracellular Domain) (D4V4B) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 可检测细胞内结构域的表位。Phospho-CD79A (Tyr182) (D1B9) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 仅在 Tyr188 位点被磷酸化时才可识别人 CD79A 蛋白的内源水平。它响应小鼠 CD79A 蛋白的 Tyr182。Phospho-Syk (Tyr525/526) (C87C1) Rabbit mAb (PE Conjugate) 仅在人 Syk 的 Tyr525/526 位点被磷酸化时才可识别 Syk 蛋白的内源水平。它还可检测在人 Syk 的 Tyr526 位点被单一磷酸化时的 Syk 蛋白。它不会与其他酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶发生交叉反应。

物种反应性:

来源/纯化

通过亲和层析从组织培养上清液中纯化单克隆抗体。纯化的抗体在最佳条件下偶联,未反应的染料从制剂中去除。

有限使用

除非如以 CST 合法授权代表签署的书面形式另行明确同意,否则以下条款适用于 CST、其附属公司或其分销商提供的产品。除非 CST 合法授权代表以书面形式单独接受,否则任何附加于或异于此处所载条款和条件的客户条款和条件均被拒绝且无效。

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