PathScan^® RP Phospho-Atg14 (Ser29) Sandwich ELISA Kit #71484

PathScan^® 夹心式 ELISA 实验步骤（快速实验步骤）

注：此实验步骤用于使用直接与检测用抗体偶联的 HRP 的 PathScan^® 试剂盒（快速实验步骤），而不用于依次添加检测用抗体和 HRP 二抗的两步法。

A. 溶液与试剂

注意：用去离子水/纯净水或等效水制备溶液。

1. 微孔板条板：在打开袋子/使用之前，请将其全部恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
2. 检测抗体：用 5.5 mL HRP 稀释剂重新配制冻干检测抗体（红色块状物）。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。为获得最佳结果，请在重新配制抗体后立即使用。未使用的经重新配制的检测抗体可在 4°C 下保存长达 4 周，尽管与最新配制的抗体相比可能会存在一些信号丢失。
3. HRP 稀释剂：红色稀释剂用于用于重组和稀释与 HRP 相关的检测抗体。
4. 1X ELISA 洗涤缓冲液：通过用去离子水将 ELISA Wash Buffer (20X)（每个试剂盒中均有提供）稀释至 1X 来制备。
5. 1X 细胞裂解缓冲液：通过用去离子水将 10X Cell Lysis Buffer #9803 稀释至 1X 来制备。这种缓冲液可以贮存在 4°C 供短期使用（1–2 周）。建议：用于制备细胞裂解物时，在使用前立即添加 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail（#5872，未提供）和 1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF，#8553，未提供）。
6. TMB 底物 (#7004)：使用前请恢复至室温。
7. STOP 溶液 (#7002)：使用前请恢复至室温。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 mL 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail），平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
5. 在冰上超声处理裂解物。
6. 在 4°C 下微量离心（14,000 rpm）10 分钟，随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 10⁶ 个活细胞/mL 时，通过低速离心（约 1200 rpm）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 通过低速离心（约 1200 rpm）收集细胞，并用 5-10 mL 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
3. 从 50 mL 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 mL 1X 细胞裂解缓冲液（含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail）中进行裂解。
4. 在冰上超声处理裂解物。
5. 在 4°C 下微量离心（14,000 rpm）10 分钟，随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

注：在运行检测之前，请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

1. 如上（第 A 部分）所述制备所有试剂。
2. 样品应不作稀释或用 1X 细胞裂解缓冲液稀释至 2X 蛋白浓度，以便在添加检测抗体后达到最终的 1X 蛋白浓度。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线，可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型结果。
3. 向对应的孔添加 50 μL 每种样品。
4. 向每个孔中添加 50 µL 检测抗体。
5. 对平板进行密封，并在室温下于设定为 400 rpm（中度振荡）的平板摇床上孵育 1 小时。
6. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
1. 将平板内容物弃入容器中。
2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔每次 200 µL。
3. 每次洗涤时，将平板重重拍在未用过的毛巾上，以便去除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让微孔完全干燥。
4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
7. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封并在平板摇床（400 rpm，中度振荡）上于室温下黑暗环境中对平板进行孵育 15 分钟，或者在不振荡的情况下于 37°C 下孵育 10 分钟。
8. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP 溶液，就变为黄色。

9. 读取结果：
1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。