PathScan^® Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Antibody Pair #7143

ELISA Antibody Pair

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 并混合。
2. 洗涤缓冲液：1X PBS/0.05% Tween^® 20、(20X PBST #9809)。
3. 封闭缓冲液：1X PBS/0.05% Tween^® 20、1% BSA。

4. 1X 细胞裂解缓冲液：10X 细胞裂解缓冲液 (#9803)：要配制 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，则添加 10X 细胞裂解缓冲液到 9 ml dH₂O 中，混匀。这种缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用（1-2 周）。

   建议：使用前，立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (#8553)。

5. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
6. TMB 底物：(#7004)。

7. STOP 溶液：(#7002)

   注意：试剂应每天新鲜制备。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
5. 在冰上超声处理裂解物。
6. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 10⁶ 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1,200 转/分钟）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 通过低速离心（约 1,200 转/分钟）收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
4. 在冰上超声处理裂解物。
5. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 包被程序

1. 用 200 µl dH₂O 淋洗微量平板，弃去液体。在纸巾上蘸干以确保各孔干燥。
2. 在 1 X PBS 中 1:100 稀释捕获抗体。对于单块 96 孔板，添加 100 µl 捕获抗体母液至 9.9 ml 1 X PBS。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 4°C 孵育过夜（17–20 小时）。
3. 在过夜包被后，轻柔地揭开平板的盖子，并洗涤各孔：
   1. 将平板内容物弃入容器中。
   2. 用洗涤缓冲液洗涤 4 次，每次 200 µl/孔。每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上，拍击力度要足够大，这样才能清除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
   3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
4. 封闭平板。添加 150 µl 封闭缓冲液/孔，盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
5. 在封闭后，洗涤平板（C 部分，步骤 3）。平板可直接使用。

D. 检测程序

1. 裂解物可以不稀释使用或在封闭缓冲液中稀释使用。每孔添加 100 µl 裂解物。盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
2. 洗涤平板（C 部分，步骤 3）。
3. 在封闭缓冲液中 1:100 稀释检测抗体。对于单块 96 孔板，添加100 µl 检测抗体母液至 9.9 ml 封闭缓冲液中。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 1 小时。
4. 洗涤平板（C 部分，步骤 3）。
5. 将二抗，即链霉亲和素抗小鼠或抗兔-HRP，在封闭缓冲液中 1: 1000 稀释。对于单块 96 孔板，添加 10 µl 二抗母液至 9.99 ml封闭缓冲液。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 30 分钟。
6. 洗涤平板（C 部分，步骤 3）。
7. 向每个孔中添加 100 µl TMB Substrate。盖住平板并在 37°C 孵育 10 分钟。
8. 向每个孔中添加 100 µl STOP Solution。温和振摇数秒。
9. 在微量平板读数仪上在 450 nm 吸光度读取平板。
   1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
   2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。在添加 STOP Solution 后 30 分钟内在 450 nm 读取吸光度。