对促销感兴趣？ | 点击此处 >>
7143
PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Antibody Pair
ELISA 试剂盒
ELISA Antibody Pair
  1. 产品
  2. ELISA 试剂盒
  3. PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Antibody Pair

PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Antibody Pair #7143

引用 (2)
PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Antibody Pair: Image 1

未经处理和已经 PDGF 处理的 NIH/3T3 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 PathScan Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Antibody Pair #7143 时在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。饥饿过夜后，NIH/3T3 细胞在 37ºC 下用 PDGF (50 ng/ml) 处理 20 分钟后再进行裂解。

图像库
了解有关我们如何获得图像的详情
购买 # 7143S
产品货号 规格 价格 库存
7143S		 1 个试剂盒（试剂可用于 4 x 96 孔板）

定制制剂

重要订购明细

客户订购明细： 产品订购后组配。请为订单处理时间预留三个工作日。

支持数据

反应性 H M R

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

抗体对已使用建议的缓冲液、试剂、平板和包含的实验步骤进行优化。溶液应每天新鲜配制。

保存

捕获和检测抗体存储在 4ºC。HRP 标记二抗保存在 -20°C 下。

实验步骤

打印

查看 > 折叠 >

ELISA Antibody Pair

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 洗涤缓冲液：1X PBS/0.05% Tween® 20、(20X PBST #9809)。
  3. 封闭缓冲液：1X PBS/0.05% Tween® 20、1% BSA。

  4. 1X 细胞裂解缓冲液：10X 细胞裂解缓冲液 (#9803)：要配制 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，则添加 10X 细胞裂解缓冲液到 9 ml dH2O 中，混匀。这种缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用（1-2 周）。

    建议：使用前，立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (#8553)。

  5. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  6. TMB 底物：(#7004)。

  7. STOP 溶液：(#7002)

    注意：试剂应每天新鲜制备。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1,200 转/分钟）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心（约 1,200 转/分钟）收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 包被程序

  1. 用 200 µl dH2O 淋洗微量平板，弃去液体。在纸巾上蘸干以确保各孔干燥。
  2. 在 1 X PBS 中 1:100 稀释捕获抗体。对于单块 96 孔板，添加 100 µl 捕获抗体母液至 9.9 ml 1 X PBS。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 4°C 孵育过夜（17–20 小时）。
  3. 在过夜包被后，轻柔地揭开平板的盖子，并洗涤各孔：
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用洗涤缓冲液洗涤 4 次，每次 200 µl/孔。每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上，拍击力度要足够大，这样才能清除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
    3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  4. 封闭平板。添加 150 µl 封闭缓冲液/孔，盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  5. 在封闭后，洗涤平板（C 部分，步骤 3）。平板可直接使用。

D. 检测程序

  1. 裂解物可以不稀释使用或在封闭缓冲液中稀释使用。每孔添加 100 µl 裂解物。盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  2. 洗涤平板（C 部分，步骤 3）。
  3. 在封闭缓冲液中 1:100 稀释检测抗体。对于单块 96 孔板，添加100 µl 检测抗体母液至 9.9 ml 封闭缓冲液中。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 1 小时。
  4. 洗涤平板（C 部分，步骤 3）。
  5. 将二抗，即链霉亲和素抗小鼠或抗兔-HRP，在封闭缓冲液中 1: 1000 稀释。对于单块 96 孔板，添加 10 µl 二抗母液至 9.99 ml封闭缓冲液。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 30 分钟。
  6. 洗涤平板（C 部分，步骤 3）。
  7. 向每个孔中添加 100 µl TMB Substrate。盖住平板并在 37°C 孵育 10 分钟。
  8. 向每个孔中添加 100 µl STOP Solution。温和振摇数秒。
  9. 在微量平板读数仪上在 450 nm 吸光度读取平板。
    1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。在添加 STOP Solution 后 30 分钟内在 450 nm 读取吸光度。

发布​于 2008 年 1 月 

修订于 2013 年 9 月

实验步骤编号：20

产品说明

CST 的 PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Antibody Pair 是 PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Kit #7160 的一种经济合算的替代物。捕获和检测抗体以及 HRP 标记二抗分别作为 100X 原液和 1000X 原液提供。提供的试剂足以进行 4 x 96 孔的 ELISA 测定。Phospho-Akt (Ser473) Rabbit Capture Antibody 在 96 孔微孔板中 PBS 包被过夜。封闭后，加入细胞裂解物，随后加入 Akt1 Mouse Detection Antibody 和 HRP-conjugated Anti-Mouse IgG。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与磷酸-Akt1 (Ser473) 蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

特异性/敏感性

如需了解抗体对的特异性和敏感度，请参阅相应的 PathScan® Sandwich ELISA Kit。注意：经内部测试确定，该抗体对可检测规定物种中的蛋白，但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠

背景

Akt 也称作 PKB 或 Rac，在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活，并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ，以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的 PDK2 可在 Ser473 处磷酸化 Akt ，它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标 (mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标（包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和 caspase-9）而抑制凋亡，进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3 激酶/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外，Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和 cyclin D1 降解 (14)，并通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16)，参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR，在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要的是，Akt 磷酸化并失活结节蛋白 (TSC2)（在 mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制分子）(18,19)。

  1. Franke , T. F. et al. (1997) Cell 88, 435-437.
  2. Burgering, B.M. and Coffer, P.J. (1995) Nature 376, 599-602.
  3. Franke, . F. et al. (1995) Cell 81, 727-736.
  4. Alessi, D. R. et al. (1996) EMBO J. 15, 6541-6551.
  5. Sarbassov, D.D. et al. (2005) Science 307, 1098-101.
  6. Jacinto, E. et al. (2006) Cell 127, 125-37.
  7. Cardone, M.H. et al. (1998) Science 282, 1318-21.
  8. Brunet, A. et al. (1999) Cell 96, 857-68.
  9. Zimmermann, S. and Moelling, K. (1999) Science 286, 1741-4.
  10. Cantley, L.C. and Neel, B.G. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 4240-5.
  11. Vlahos, C.J. et al. (1994) J Biol Chem 269, 5241-8.
  12. Hajduch, E. et al. (2001) FEBS Lett 492, 199-203.
  13. Cross, D.A. et al. (1995) Nature 378, 785-9.
  14. Diehl, J.A. et al. (1998) Genes Dev 12, 3499-511.
  15. Gesbert, F. et al. (2000) J Biol Chem 275, 39223-30.
  16. Zhou, B.P. et al. (2001) Nat Cell Biol 3, 245-52.
  17. Navé, B.T. et al. (1999) Biochem J 344 Pt 2, 427-31.
  18. Inoki, K. et al. (2002) Nat Cell Biol 4, 648-57.
  19. Manning, B.D. et al. (2002) Mol Cell 10, 151-62.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

除非 CST 的合法授书代表以书面形式书行明确同意，否书以下条款适用于 CST、其关书方或分书商提供的书品。 任何书充本条款或与本条款不同的客书条款和条件，除非书 CST 的合法授书代表以书面形式书独接受， 否书均被拒书，并且无效。

专品专有“专供研究使用”的专专或专似的专专声明， 且未专得美国食品和专品管理局或其他外国或国内专管机专专专任何用途的批准、准专或专可。客专不得将任何专品用于任何专断或治专目的， 或以任何不符合专专声明的方式使用专品。CST 专售或专可的专品提供专作专最专用专的客专，且专用于研专用途。将专品用于专断、专防或治专目的， 或专专售（专独或作专专成）或其他商专目的而专专专品，均需要 CST 的专独专可。客专：(a) 不得专独或与其他材料专合向任何第三方出售、专可、 出借、捐专或以其他方式专专或提供任何专品，或使用专品制造任何商专专品，(b) 不得复制、修改、逆向工程、反专专、 反专专专品或以其他方式专专专专专品的基专专专或技专，或使用专品开专任何与 CST 的专品或服专专争的专品或服专， (c) 不得更改或专除专品上的任何商专、商品名称、徽专、专利或版专声明或专专，(d) 只能根据 CST 的专品专售条款和任何适用文档使用专品， (e) 专遵守客专与专品一起使用的任何第三方专品或服专的任何专可、服专条款或专似专专

仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink