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7410
HTScan® EGFR Kinase Assay Kit
细胞检测试剂盒
检测试剂盒

HTScan® EGFR Kinase Assay Kit #7410

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图 3. EGF-R 激酶活性的剂量依赖性曲线:使用 Phospho-Tyrosine Monoclonal Antibody PY100 #9411 检测 GST-EGF-R 激酶对肽 C03-1727 的磷酸化可产生 DELFIA® 数据。在 50 µl 反应体积中,每个反应孔在 25ºC 下用数量递增的 GST-EGF-R 和 5 µM 底物肽反应 30 分钟。背景读数为 11152。(DELFIA® 是 PerkinElmer, Inc. 的一个注册商标)。

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图 6. Iressa 和 staurosporine 会抑制 EGF-R 激酶活性:使用 Phospho-Tyrosine Monoclonal Antibody P-Tyr-100 #9411 检测 GST-EGF-R 激酶对 EGF-R 底物肽 (C03-1727) 的磷酸化可产生 DELFIA® 数据。在 50 ul 反应体积中,每个反应孔在 25ºC 下用 10 单位的 GST-EGF-R、1.5 uM 底物肽、20 uM ATP 和数量递增的抑制剂(iressa 或 staurosporine)反应 30 分钟。(DELFIA® 是 PerkinElmer, Inc. 的一个注册商标)。

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图 4. EGF-R 激酶活性的肽浓度依赖性:使用 Phospho-Tyrosine Monoclonal Antibody P-Tyr-100 #9411 检测 GST-EGF-R 激酶对肽 C03-1727 的磷酸化可产生 DELFIA® 数据。在 50 ul 反应体积中,每个反应孔在 25ºC 下用 10 单位的 GST-EGF-R 和浓度递增的底物肽反应 30 分钟。背景读数为 8985。(DELFIA® 是 PerkinElmer, Inc. 的一个注册商标)。

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图 1. EGF-R 激酶活性的时程:使用 Phospho-Tyrosine Monoclonal Antibody P-Tyr-100 #9411 检测 GST-EGF-R 激酶对 EGF-R 底物肽的磷酸化可产生 DELFIA® 数据。在 50 ul 反应体积中,每个反应孔用 10 单位的 GST-EGF-R 和 5 uM 底物肽。背景读数为 5144。(DELFIA® 是 PerkinElmer, Inc. 的注册商标)。

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图 2. Tyrosine Kinase Substrate Screening Kit #7450 用 EGF-R 激酶处理。阳性对照为黄色,阴性对照为蓝色。使用这种方法可检测到 EGF-R 的多个阳性采样数(红色)。星号表示为该 HTScan® EGF-R Kinase Assay Kit 选择的肽。

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图 5. 在使用以下反应条件的放射性同位素过滤检测中可检测 EGF-R 激酶活性:60 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)、3 mM MgCl2、3 mM MnCl2、3 uM 原钒酸钠、1.2 mM DTT、ATP(可变)、2.5 ug / 50 ul PEG20.000,底物:PolyEY 10 ug/50 ul,重组 EGF-R:5 单位/50 ul。

特异性/敏感性

质量控制:通过使用 Tyrosine Kinase Substrates Screening Kit #7450 筛选 EGF-R 激酶底物来选择 PTP1B 肽。使用 Phospho-Tyrosine Monoclonal Antibody #9411 进行检测(图 2)。生物素化肽的质量通过反相 HPLC 和质谱法进行评价。

纯化的 EGF-R 激酶通过使用银色染剂 SDS-PAGE 和蛋白质印迹实验对纯度进行质量控制。测量的 EGF-R 激酶 Vmax 和 Km 值可用于确定特定酶活性(图 5)。

EGFR 激酶活性的检测条件(时程 [图 1]、激酶剂量依赖性 [图 3]、底物剂量依赖性 [图 4] 和抑制剂敏感性 [图 6])使用该试剂盒中提供的 EGF-R 底物肽进行验证。

背景

表皮生长因子 (EGF) 受体是一种 HER/ErbB 蛋白家族的跨膜酪氨酸激酶。配体结合后,会导致受体二聚化、自磷酸化、下游信号转导激活、内化以及溶酶体降解 (1,2)。激酶结构域中 EGF 受体 (EGFR) 在 Tyr845 的磷酸化具有稳定激活环、维持酶激活状态以及为底物蛋白提供结合表面的作用 (3,4)。c-Src 与 EGFR 在 Tyr845 的磷酸化有关 (5)。PLCγ 的 SH2 结构域在磷酸化的 Tyr992 位点结合,从而激活 PLCγ 介导的下游信号转导 (6)。EGFR 在 Tyr1045 的磷酸化为接头蛋白 c-Cbl 提供了一个主要锚定位点,以便让 EGFR 在激活后进行受体泛素化和降解 (7,8) GRB2 接头蛋白在磷酸化-Tyr1068 位点与激活的 EGFR 相结合 (9)。一对磷酸化的 EGFR 残基(Tyr1148 和 Tyr1173)为 Shc 支架蛋白提供了一个锚定位点,两个位点都参与了 MAP 激酶信号转导的激活 (2)。EGFR 在特定丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化会降低 EGFR激酶活性。EGFR 羧基末端残基 Ser1046 和 Ser1047 被 CaM 激酶 II 磷酸化,其中任何一个丝氨酸突变都会导致 EGFR 酪氨酸自磷酸化上调 (10)。

描述:该试剂盒提供一种方法来使用活化的人 EGF-R 激酶进行酶检测。它包含活化的 EGF-R 激酶(以 GST 融合蛋白的形式保存)、生物素化底物肽以及用于检测磷酸化底物肽的磷酸化酪氨酸单克隆抗体。

单位定义:10单位是指在经 DELFIA® 定量分析的 50 µl 总反应体积中,在 25ºC 下30 分钟内最大程度磷酸化 75 pmol PTP1B (Tyr66) #C03-1727 生物素化底物肽所需的 EGF-R 激酶数量。

肽核心序列:NDY*IN

分子量:Peptide Substrate, Biotin-PTP1B (Tyr66):2141 道尔顿;GST-EGF-R 激酶结构域:91,163 道尔顿

保存:抗体保存在 10 mM 钠 HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。切勿分装抗体。肽保存在 6 µM 0.001% DMSO 中。酶保存在 50 mM Tris-HCL (pH 8.0)、100 mM NaCl、5 mM DTT、15 mM 还原谷胱甘肽和 20% 甘油中。保存在 -80ºC 下。

使用期间,酶保存在冰上。

避免重复的冻融循环。

  1. Hackel, P.O. et al. (1999) Curr Opin Cell Biol 11, 184-9.
  2. Zwick, E. et al. (1999) Trends Pharmacol Sci 20, 408-12.
  3. Cooper, J.A. and Howell, B. (1993) Cell 73, 1051-4.
  4. Hubbard, S.R. et al. (1994) Nature 372, 746-54.
  5. Biscardi, J.S. et al. (1999) J Biol Chem 274, 8335-43.
  6. Emlet, D.R. et al. (1997) J Biol Chem 272, 4079-86.
  7. Levkowitz, G. et al. (1999) Mol Cell 4, 1029-40.
  8. Ettenberg, S.A. et al. (1999) Oncogene 18, 1855-66.
  9. Rojas, M. et al. (1996) J Biol Chem 271, 27456-61.
  10. Feinmesser, R.L. et al. (1999) J Biol Chem 274, 16168-73.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。
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