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13859
Cellular Glutathione Detection Assay Kit
细胞检测试剂盒
检测试剂盒

Cellular Glutathione Detection Assay Kit #13859

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FUNC Image 1 - Cellular Glutathione Detection Assay Kit

图 5. 未经处理(绿色)或已经特非那定(200 μΜ,4 小时;蓝色)处理的 Jurkat 细胞用 MCB(100 μΜ,30 分钟)标记,并使用 380 nm 的激发光波长和约 460 nm 的发射光波长进行直接的流式细胞分析。

FUNC Image 2 - Cellular Glutathione Detection Assay Kit

图 1. 还原谷胱甘肽标准液用 Tris 检测缓冲液稀释,并对样品进行检测,以绘制标准曲线。该标准曲线仅用作演示目的;用户应为每个样品组绘制标准曲线,以准确确定谷胱甘肽水平。

FUNC Image 3 - Cellular Glutathione Detection Assay Kit

图 2. Raw 264.7、HeLa 和 Jurkat 细胞按不同细胞密度接种在 96 孔板中。使用 Cellular Glutathione Detection Assay Kit 对两种细胞提取物(上图)和活细胞(下图)进行细胞谷胱甘肽水平检测。

FUNC Image 4 - Cellular Glutathione Detection Assay Kit

图 3. 未经处理和已经 Staurosporine #9953 (2.0 μΜ) 处理的 HeLa 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 Cellular Glutathione Detection Assay Kit 检测的 RFU 之间的关系如图所示。

FUNC Image 5 - Cellular Glutathione Detection Assay Kit

图 4. HeLa 细胞(4x104 个细胞/孔)用特非那定(规定浓度,4 小时)处理,并使用 Cellular Glutathione Detection Assay Kit 检测还原谷胱甘肽的水平。使用激发光波长为 380 nm 和发射光波长约 460 nm 的荧光读板机来测量相对荧光单位 (RFU)。

FUNC Image 6 - Cellular Glutathione Detection Assay Kit

图 6. 未经处理或已经特非那定(200 μΜ,4 小时)处理的 Jurkat 细胞用 MCB(100 μΜ,30 分钟)和 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087 标记,并在荧光显微镜下进行分析。活细胞(未经处理)显示较高的还原谷胱甘肽水平(蓝色),而死细胞(经处理)因其质膜受损而出现 PI(红色)染色。

购买 # 13859S
产品货号 规格 价格 库存
13859S
1 个试剂盒(200 次检测;96 孔样式)

产品包括 数量(计数) 保存温度
Reduced Glutathione Standard 1 x 1 次 -20°C
Glutathione-S-Transferase 1 x 1 次 -20°C
Tris Assay Buffer 1 x 25 ml 4°C
Digitonin Lysis Buffer 1 x 11 ml -20°C
Monochlorobimane 1 x 1 次 -20°C

保存

收到后,应从 #13859 中取出 Tris Assay Buffer (#13865) 并将其保存在 4°C 下。剩余组分应保存在 -20ºC 下。

实验步骤

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#13859 Cellular Glutathione Detection Assay Kit 实验步骤

A. 溶液和试剂

  1. 还原谷胱甘肽标准品:在 100 µl Tris 分析缓冲液中复溶冻干产物,以制备 100 mM 溶液。
  2. 谷胱甘肽-S-转移酶:用 110 µl Tris 分析缓冲液复溶冻干产品。
  3. Tris 检测缓冲液:使用前将其恢复至室温。
  4. 洋地黄皂苷裂解缓冲液:使用时解冻并置于冰上。
  5. Monochlorobimane:用 44 µl DMSO 复溶冻干产品。

还原谷胱甘肽工作液 如下所述(见表 1)。

表 1:一个 96 孔板的 GSH 工作液(100 分析)

试剂盒组分 体积 (µl)
Monochlorobimane 20
谷胱甘肽-S-转移酶 50
Tris 检测缓冲液 4930
总量: 5000

注意:要创建 GSH 标准曲线,请通过在 Tris 分析缓冲液中以 1:1000 稀释 100 mM 还原型谷胱甘肽标准品来制备 100 µM GSH 标准溶液。每孔使用 50 µl 标准液,三个重复样品运行标准曲线。通过从 100 µM 开始并在 Tris Assay Buffer 中以 1:2 连续稀释来制作五点标准曲线。包括空白对照。GSH 标准溶液在此浓度下不稳定,应该在 2 小时内使用或丢弃。

其他试剂(未提供):DMSO ( #12611)

B. 制备细胞提取物

  1. 细胞提取物的制备(10 cm 培养皿)
    1. 应用所需的处理方案并制备未经处理的对照样品。
    2. 处理后,抽吸培养基并向每个样品中添加 1.0 ml Digitonin Lysis Buffer,使用小表面积容器时调整 Digitonin Lysis Buffer 的体积。

      注意:如果使用悬浮或分离的细胞,收集并于 1,200 rpm 离心细胞悬浮液 5 min。丢弃上清液,并将 Digitonin Lysis Buffer 添加到细胞沉淀物中。

    3. 在冰上孵育细胞裂解物 5-10 min。
    4. 从板上刮下细胞,将悬浮液转移至微量离心管。
    5. 在 4°C 下以 14,000 rpm 分离细胞裂解物 10 min。
    6. 采集上清液并运行检测,或在 -80°C 下储存,以供稍后使用。

      注意:使用10 kDa MWCO 离心过滤器,对于需要额外过滤步骤的细胞,请遵循制造商的说明。

  2. 从 96 孔检测板制备细胞提取物
    1. 处理后,以 1,200 rpm 离心分析板 10 min 并小心地去除上清液。
    2. 向每孔添加 50 µl Digitonin Lysis Buffer,并在摇床上室温孵育 15 分钟。
    3. 将样品转移到微量离心管中,并在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 10 min。
    4. 收集上清液并立即进入 GSH 测定。

C. 检测程序

  1. 检测细胞提取物中的还原谷胱甘肽
    1. 将 Tris Assay Buffer 与供试样品、GSH标准品和工作液混合在黑色的 96 孔板中,底部透明,最终体积为 100 µl(请参见表 2)。
    2. 表 2:检测和标准曲线分析

      样品 供试样品 (µl) GSH 标准品 (µl) 工作液 (µl) 测定缓冲液 (µl) 总体积 (µl)
      空白 - - 50 50 100
      标准品 - 50 50 - 100
      样品 1-50 - 50 50 减去样品量 100

    3. 在室温下培养测定板 60 min,避光。
    4. 用酶标仪在激发波长约为 380nm,发射波长约为 485nm 的情况下读取板。
  2. 在活细胞中检测还原谷胱甘肽 (GSH)

    以下步骤使用 96 孔板测量活细胞中的还原谷胱甘肽。可以修改相同的实验步骤进行荧光成像和流式细胞术检测。

    1. 在 96 孔黑色培养板中培养粘附细胞或悬浮细胞,一式两份,最少 16 小时。通过使用包含生长培养基但没有细胞的至少 2 孔来确定背景读数。

      注意:为了最佳结果,建议进行细胞数滴定,以测定最佳细胞接种密度。我们建议每孔不要超过 1x105 细胞。

    2. 通过在 Tris Assay Buffer 中以 1:50 稀释复溶的 Monochlorobimane 储备液,制备活细胞染色工作液。例如,在 1 ml Tris Assay Buffer 中稀释 20 µl Monochlorobimane 储备液,制成 1 ml 活细胞染色工作液,足以用于一个 96 孔板。轻轻敲打板的每一侧来混合试剂。
    3. 将 10 µl 活细胞染色工作液添加至含 100 µl 生长培养基的每个孔中。
    4. 在 CO 2 培养箱中培养样品 30 min。为获得最佳结果,每 30 min(最长 3 小时)测量一次荧光强度,或直到信号达到稳定水平。

发布​于 2020 年 6 月 

实验步骤编号:2050

产品说明

Cellular Glutathione Detection Assay Kit 可在细胞测定法中使用可渗透细胞的染料单氯二胺 (MCB) 来检测还原型谷胱甘肽 (GSH)。MCB 对还原型谷胱甘肽具有高亲和力,在溶液中游离时,具有非常低的荧光产生率。结合 GSH 时,染料会产生强蓝色荧光,可在激发光波长为 380 nm 且发射光波长为 460 nm 时检测。荧光强度与样品 GSH 水平有关。该试剂盒可用于直接标记细胞或检测细胞提取物中的 GSH 水平。这种测定法可很容易地用于高通量平板样式、流式细胞术或荧光显影。

特异性/敏感性

Cellular Glutathione Detection Assay Kit 预计在所有物种的细胞测定法中可检测还原型谷胱甘肽。

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

预期的所有物种

背景

在还原和氧化状态的细胞中均会发现抗氧化剂谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽在预防活性氧簇(包括自由基和过氧化物)所致的细胞损伤方面发挥重要作用。在有自由基和过氧化物的情况下,还原型谷胱甘肽 (GSH) 充当电子供体被氧化 (GSSG)。GSH 还通过去除细胞第二信使 H2O2 来参与氧化还原反应的信号转导 (1,2)。在衰老过程以及氧化应激相关的疾病中会观察到谷胱甘肽水平下降。GSH 缺失对不同信号转导通路介导的凋亡进程非常重要 (3,4)。胞内 GSH 水平是整体细胞健康、增殖和死亡的一个非常有用的指示 (2)。

  1. Dickinson, D.A. and Forman, H.J. (2002) Ann N Y Acad Sci 973, 488-504.
  2. Pompella, A. et al. (2003) Biochem Pharmacol 66, 1499-503.
  3. Franco, R. et al. (2007) J Biol Chem 282, 30452-65.
  4. Macho, A. et al. (1997) J Immunol 158, 4612-9.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
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