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9669
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
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Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #9669

引用 (40)
筛选器：
  1. IF
  2. F
Immunofluorescence Image 1: Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody (Alexa Fluor® 488 Conjugate)（绿色）对未经处理（左图）或已经 staurosporine（右图）处理的 Hela 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白纤丝用 Alexa Fluor® 555 phalloidin #8953（红色）进行标记。蓝色伪彩 = DRAQ5®（DNA 荧光染料）。
Flow Cytometry Image 1: Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) 抗体(Alexa Fluor® 488 偶联物)（实线）或浓度匹配的兔 (DA1E) 单克隆抗体 IgG XP® 同型对照 (Alexa Fluor® 488 偶联物) #2975（虚线）对未经（蓝色）或已经 etoposide #2200（25 μM，过夜；绿色）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。
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9669S		 100 µl （50 次测试）

定制制剂

支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa)
来源 兔

应用缩写：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体接合 Alexa Fluor® 488 荧光染料，并可对人体细胞进行直接的流式细胞术和免疫荧光分析内部检测。该抗体显示的物种交叉反应性预计与非偶联的 Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody #9661 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:50
流式细胞术 1:50

保存

保存在 PBS（pH 为 7.2）、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。请不要分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

实验步骤

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免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100)：要配制 10 ml：添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH2O 中，混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。
  5. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意：甲醛有毒性，需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  7. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2013 年 11 月

实验步骤编号：182

针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤（流式细胞术）

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛，不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604)：用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。

注意：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经流式细胞术验证的细胞染料完整列表。

B. 固定

注：固定前，应分离黏附细胞或组织，并放在单细胞悬浮液中。

注意：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，这类抗体保持结合目的靶标。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀，并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物，并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者，细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度，以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。（通常，每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。）
  2. 通过离心分离，用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：407

特异性/敏感性

Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 可检测内源水平的活化 caspase-3 中的大片段 (17/19 kDa) ，该片段由天冬氨酸 175 附近的裂解活化产生。该抗体不可识别全长 caspase-3 或其他裂解活化的 caspase 。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 猴

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种：

牛 , 犬 , 猪

来源/纯化

使用与人 caspase-3 中 Asp175 附近的氨基末端残基相对应的合成肽，对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。该抗体在最合适的条件下接合 Alexa Fluor® 488，其中 F/P 比值为 2-6。

背景

Caspase-3 (CPP-32, Apoptain, Yama, SCA-1) 是一个凋亡的关键执行者，因为它对许多关键的蛋白起着部分或全部的裂解作用，比如核酶多聚 (ADP-ribose) 聚合酶 (PARP) (1)。caspase-3 的激活需要经过其未活化的酶原形式转变为活化的 p17 和 p12 片段的蛋白水解过程。caspase-3 的剪切需要位于 P1 位点的天门冬氨酸残基 (2)。
  1. Fernandes-Alnemri, T. et al. (1994) J Biol Chem 269, 30761-4.
  2. Nicholson, D.W. et al. (1995) Nature 376, 37-43.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
DRAQ5 是 Biostatus Limited 的注册商标。
本产品中的 Alexa Fluor 染料偶联抗体经 Life Technologies Corporation 许可销售，仅供研究使用，不可与 DNA 微阵列结合使用。Alexa Fluor430® 染料（除 Alexa Fluor® 染料外）是待审批的授权专利。Alexa Fluor® 是 Molecular Probes, Inc 的注册商标。
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