用于 Illumina 系统的 CUT&Tag DNA 文库制备实验步骤

下一代测序 (NG-seq) 是一种可在靶向切割和标签化 (CUT&Tag) 测定法下游用于辨识并定量靶标 DNA 遍及整个基因组富集情况的高通量方法。CUT&Tag Dual Index Primers 和 PCR Master Mix for Illumina Systems 试剂盒非常适合多重样品制备供 Illumina 系统平台上进行 NG-seq。这种试剂盒可以用于生成多达 96 个可合并入单个测序反应中的不同、条形码化 CUT&Tag DNA 文库。本产品兼容于借助 CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561 生成的 CUT&Tag DNA 样品以及来自其他标签化测定法（例如 ATAC-seq）的 DNA 样品。本产品不兼容来自 SimpleChIP^® Chromatin IP Kits（#9003、#9005、#56383）的 ChIP-DNA 或来自 CUT&RUN Assay Kit (#86652) 的 CUT&RUN DNA 。

兼容性试剂：

• CUT&Tag Assay Kit #77552
• CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561

非兼容性检测试剂盒：

• SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
• SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
• SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
• SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
• SimpleChIP^® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
• CUT&RUN Assay Kit #86652
• DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795
• Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
• Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580

所需的试剂

包括的试剂：

1. CUT&Tag PCR Master Mix #63228
2. CUT&Tag Index 501 Primer for Illumina Systems #84876
3. CUT&Tag Index 502 Primer for Illumina Systems #27488
4. CUT&Tag Index 503 Primer for Illumina Systems #55058
5. CUT&Tag Index 504 Primer for Illumina Systems #61793
6. CUT&Tag Index 505 Primer for Illumina Systems #70447
7. CUT&Tag Index 506 Primer for Illumina Systems #87803
8. CUT&Tag Index 507 Primer for Illumina Systems #26897
9. CUT&Tag Index 508 Primer for Illumina Systems #52106
10. CUT&Tag Index 701 Primer for Illumina Systems #71100
11. CUT&Tag Index 702 Primer for Illumina Systems #88112
12. CUT&Tag Index 703 Primer for Illumina Systems #23497
13. CUT&Tag Index 704 Primer for Illumina Systems #37884
14. CUT&Tag Index 705 Primer for Illumina Systems #50105
15. CUT&Tag Index 706 Primer for Illumina Systems #65909
16. CUT&Tag Index 707 Primer for Illumina Systems #84796
17. CUT&Tag Index 708 Primer for Illumina Systems #17160
18. CUT&Tag Index 709 Primer for Illumina Systems #29209
19. CUT&Tag Index 710 Primer for Illumina Systems #41919
20. CUT&Tag Index 711 Primer for Illumina Systems #54212
21. CUT&Tag Index 712 Primer for Illumina Systems #70020

未包括的试剂：

1. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
2. 80% 乙醇（新鲜制备）
3. 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）
4. 磁力架/支架
5. Agilent Bioanalyzer 系统和 Agilent High Sensitivity DNA Kit (5067-4626)
6. PCR 管或板和 PCR 仪

CUT&Tag Dual Index Primers 和 PCR Master Mix for Illumina Systems 实验步骤

安全停止	如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。

I. 简单的合并指南：

双索引引物策略利用每个引物内的两个 8 碱基索引。Index 7 引物包含 P7 序列周围的索引，而 index 5 引物则包含 P5 序列周围的索引。对序列待测的样品的两端添加特殊索引，即可实现双索引。将 12 index 7 引物的一端与 8 index 5 引物的一端结合在一起，便可为多达 96 种不同样品建立特殊索引。

Illumina NG-seq 系统使用红色激光/LED 给 A/C 测序，并使用绿色激光/LED 给 G/T 测序。对于每个周期，需要读取红色和绿色通道，以确保获得正确的图像配准（即 A 或 C 必须存在于每个周期中，且 G 或 T 也必须存在于每个周期中）。如果未保持色彩平衡，则该索引读数测序可能会无效。请检查每个要使用的索引的序列，以确保每个周期的红色和绿色通道中都有信号。请参见以下示例：

GOOD
CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems		CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems
索引 701	ATTACTCG	索引 503	CCTATCCT
索引 702	TCCGGAGA	索引 504	GGCTCTGA
索引 703	CGCTCATT	索引 505	AGGCGAAG
索引 704	GAGATTCC	索引 506	TAATCTTA
	✔✔✔✔✔✔✔✔		✔✔✔✔✔✔✔✔

BAD
CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems			CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems
索引 701	ATTACTCG	索引 502		ATAGAGGC
索引 702	TCCGGAGA	索引 504		GGCTCTGA
索引 703	CGCTCATT	索引 506		TAATCTTA
索引 704	GAGATTCC	索引 508		GTACTGAC
	✔✔✔✔✔✔✔✔			✔✔✘✔✔✘✔✘

以下表格列出了一些（但不是全部）可一起进行测序的有效索引组合：

Plex	CUT&Tag Index 7 primers for Illumina Systems	CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems
2	Index 701 和 Index 702 Index 703 和 Index 704 Index 705 和 Index 706 Index 707 和 Index 708 Index 709 和 Index 710 Index 711 和 Index 712	任何 Index 5 引物
3	Index 701、Index 702 和 Index 703 Index 703、Index 704 和 Index 705 Index 705、Index 706 和 Index 707 Index 707、Index 708 和 Index 709 Index 709、Index 710 和 Index 711	任何 Index 5 引物
4	Index 701、Index 702、Index 703 和 Index 704 Index 703、Index 704、Index 705 和 Index 706 Index 705、Index 706、Index 707 和 Index 708 Index 707、Index 708、Index 709 和 Index 710 Index 709、Index 710、Index 711 和 Index 712	任何 Index 5 引物
5-12	与任何其他 i7 引物组合的任何有效 Index 7 4-plex （根据需要）	任何 Index 5 引物
> 12	与任何其他 i7 引物组合的任何有效 Index 7 4-plex （根据需要）	Index 501、Index 502 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 503、Index 504 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 505、Index 506 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 507、Index 508 和任何其他 Index 5 引物（根据需要）

另一些其他有效组合如下文所列。选择有效的一组 CUT&Tag Index 7 引物和有效的一组 CUT&Tag Index 5 引物。将每个 CUT&Tag Index 7 引物配合每个 CUT&Tag Index 5 引物一同使用，以形成所需数目的引物对用于 PCR 扩增所需数目的 DNA 文库 。

12 样品池	(1) 一组 4 个 Index 7 引物 * 一组 3 个 Index 5 引物 (2) 一组 3 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 (3) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 2 个 Index 5 引物
26 样品池	(1) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 加上任何 Index 7 引物和任何其他两个 Index 5 引物（除了组 4） (2) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 5 个 Index 5 引物 使用 30 个引物对中的 26 个来扩增 26 个文库

II. CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems：

每份 CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina systems 以 30 µl 量提供。

产品	索引引物序列	预期的索引引物序列读段
ICUT&Tag Index 501 Primer for Illumina Systems	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA TAGCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	TATAGCCT
ICUT&Tag Index 502 Primer for Illumina Systems	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAT AGAGGCTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	ATAGAGGC
ICUT&Tag Index 503 Primer for Illumina Systems	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCC TATCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	CCTATCCT
ICUT&Tag Index 504 Primer for Illumina Systems	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGG CTCTGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	GGCTCTGA
ICUT&Tag Index 505 Primer for Illumina Systems	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAG GCGAAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	AGGCGAAG
ICUT&Tag Index 506 Primer for Illumina Systems	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA ATCTTATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	TAATCTTA
ICUT&Tag Index 507 Primer for Illumina Systems	5´- AATGATACGGGCGACCACCGAGATCTACACCA GGACGTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	CAGGACGT
ICUT&Tag Index 508 Primer for Illumina Systems	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGT ACTGACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	GTACTGAC

其中 -s- 表示硫代磷酸键。

III. CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems：

每份 CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina systems 以 20 µl 量提供。

产品	索引引物序列	预期的索引引物序列读段
ICUT&Tag Index 701 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGT AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	ATTACTCG
ICUT&Tag Index 702 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	TCCGGAGA
ICUT&Tag Index 703 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGGCATACGAGATAATGA GCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	CGCTCATT
ICUT&Tag Index 704 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCGCATACGAGATGGAAT CTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	GAGATTCC
ICUT&Tag Index 705 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTG AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	ATTCAGAA
ICUT&Tag Index 706 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAA TTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	GAATTCGT
ICUT&Tag Index 707 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTT CAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	CTGAAGCT
ICUT&Tag Index 708 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCA TTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	TAATGCGC
ICUT&Tag Index 709 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAG CCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	CGGCTATG
ICUT&Tag Index 710 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	TCCGCGAA
ICUT&Tag Index 711 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCG AGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	TCTCGCGC
ICUT&Tag Index 712 Primer for Illumina Systems	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATC GCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	AGCGATAG

其中 -s- 表示硫代磷酸键。

IV. 设置 PCR 反应

在开始之前：

• 在室温解冻 CUT&Tag Index Primers for Illumina Systems 和 CUT&Tag DNA（或任何标签化 DNA）。快速离心以从管侧壁归集所有液体。
• 确保使用的 index 7 和 index 5 引物组合有效。请参见第一和第二部分，验证是否选择了正确的引物组合。

注：更换试管之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。如果从少于 30 µl 的 CUT&Tag DNA 开始，则加入无 DNA 酶水以补足使体积至 30 µl。

1. 将以下组分添加到无菌 PCR 管或 PCR 板的单孔中。记录添加到每个 PCR 试管或孔的 CUT&Tag Index 5 引物和 CUT&Tag Index 7 引物。
    

   试剂	1 次 PCR 反应所需体积 (70 μl)
   CUT&Tag DNA（或任何标签化 DNA）	30 μl
   CUT&Tag PCR Master Mix	35 μl
   CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina Systems (10 µM)	2.5 μl
   CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina Systems (10 µM)	2.5 μl

2. 通过上下抽吸彻底混合该反应，并快速离心以从管或板孔的侧面归集所有液体。
3. 将管置于带热盖的热循环仪上，并使用以下 PCR 循环条件执行 PCR 扩增：
    

   a.	缺口填充	58°C，5 分钟
   b.	缺口填充延伸	72°C，5 分钟
   c.	初始变性	98°C，30 秒
   d.	变性	98°C，10 秒
   e.	退火和延伸	60°C，11 秒钟
   	对于每个 CUT&Tag 反应介于 20,000 个与 100,000 个之间的细胞，重复步骤 d 和 e，共 13 个循环。
   	对于每个 CUT&Tag 反应的 20,000 个以及以下细胞，重复步骤 d 和 e，共 14-16 个循环。
   	注： 过多的 PCR 循环导致文库多样性较低和/或 NGS 读出序列重复率较高。
   f.	终末延伸	72°C，1 分钟
   g.	保持	4°C

4. 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）可选地，样品可以储存在 -20°C。

V. 清除 PCR 扩增物

在开始之前：

• 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
• 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
• 对每份样品配制 400 μl 80% 乙醇。
• 对每份样品配制大约 20 μl 10 mM Tris-HCl（pH 8.0-8.5）。

注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂，则珠子太干。

注：虽然针对组蛋白修饰生成的 CUT&Tag DNA 文库通常在 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统分析时显示出较多信号，但对于非组蛋白（例如转录因子和辅因子）生成的文库往往在使用 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统时具有非常弱的信号或甚至无可见信号，但仍然生成定位率高、可确定结合峰数目高和跨整个基因组信噪比可接受的 NGS 结果。因此，我们建议对来自转录因子和辅因子 CUT&Tag 反应中在 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统分析时不显示信号的 DNA 文库制备物测序。

1. 向来自第四部分中步骤 3 的 70 μl PCR 反应添加 70 μl (1.0X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
2. 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
4. 小心清除和丢弃上清液。小心移除所有液体残留物，但勿扰动含 DNA 靶标的珠子。
5. 将新鲜配制的 200 μl 80% 乙醇添加到处于磁力架中的管/板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
6. 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
7. 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。
8. 从磁力架上取下试管/平板。通过添加 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 8.0-8.5）/样品，从珠中洗脱 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
9. 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 15 μl 含 DNA 靶标的上清液小心地转移到一支新管。（安全停止）DNA 文库可储存在 -20°C 直至进一步使用为止。
10. 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 文库的浓度应为 10-40 ng/μl。
11. 将 1 μl DNA 文库用 10mM Tris-HCl（pH 8.0-8.5）稀释至终浓度 5-10 ng/μl。根据制造商的说明，利用 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA 芯片，使用稀释的文库 DNA 确定大小分布。
12. 将纯化的最终文库样品用 10mM Tris-HCl（pH 8.0-8.5）稀释供高通量测序。请参阅 Illumina 测序手册，了解 NG-seq 所要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。