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多重荧光免疫组织化学实验

我们广泛的验证和先进技术支持可确保我们所有经 IHC-P 验证的抗体都可用于荧光多重 IHC。

多重 IHC 的优势

  1. 对每块组织切片收集最多的数据,这在组织样品有限时非常关键。
  2. 了解保留组织结构内多个靶标的共表达和空间结构,有别于备选多重方法(如:下一代测序、PCR、质谱法等)。
多重荧光免疫组织化学实验

FFPE 扁桃体上的 PD-L2(橙色)、PD-L1 (E1L3N®)(红色)、CD68(绿色)、PD-1(黄色)、CD8α(品红色)和 Pan-Keratin(蓝绿色)。

能够同时观察多个靶标在肿瘤免疫学等研究领域中非常重要,在肿瘤免疫学中,有必要将肿瘤微环境中的免疫细胞和癌细胞亚群编入目录。例如,肿瘤细胞可能会通过控制免疫检查点蛋白(如:PD-1CTLA-4TIM-3)的表达来逃避免疫检测,从而“避开”激活的 T 细胞。或者,T 细胞在摧毁肿瘤细胞方面不太有效,因为它们会发生耗竭,这是一种以免疫检查点蛋白表达、VISTA T 细胞表达改变以及出现 CD68+ 共浸润巨噬细胞为特征的现象。因此,了解复杂肿瘤微环境以及开发针对性合并治疗干预措施的关键在于:免疫检查点蛋白的分子表达谱以及免疫细胞表型分析。

多重选择

mIHC 多重选择

以酪胺为基础的多重技术的优势:

  1. 信号扩增:
    • 提供显著增强的抗原相关荧光信号。
    • 能够检测低富集度的靶标。
  2. 简化小图设计:适合任何经 IHC-P 验证的抗体,无论是宿主还是同种型抗体。

酪胺是一种有机酚,在添加催化剂 (HRP) 的情况下,它会被激活并共价结合富含电子的区域,这些区域通常是在蛋白抗原表面或附近的酪氨酸残基(见下面的示意图)。因此,HRP 催化酪胺-荧光基团分子沉淀,会使抗原位点处的荧光信号增强扩增。 

多重 IHC 示意图

酪胺-酪氨酸结合的共价性质可通过热介导清除(剥离)与抗原结合的一抗/二抗对,同时保留与抗原相关的荧光信号。这可促进连续使用相同宿主或同种型的多种一抗,而无需担心会发生交互作用,从而大大提高多重技术潜能。

成功的条件

以酪胺为基础的荧光 mIHC 需要满足以下因素:

  1. 建议用于 IHC-P 的、经严格验证且高度特异性的一抗 (Ab)。
    :CST 提供的所有经 IHC-P 验证的 Ab 都可用于荧光 mIHC。
  2. 二抗对一抗的宿主/同种型具有特异性,且偶联 HRP,HRP 是一种可催化酪胺激活和永久沉淀的酶。
    :也可使用直接偶联 HRP 的一抗。
  3. 酪胺-荧光基团偶联物。
  4. 用于超过 3 个靶标的 mIHC 小图的多谱段相机以及一种胞核复染剂。

抗体小图的大小在很大程度上决定了选择的显影系统。

  • 较小小图尺寸(1-3 靶标/荧光基团);在低重环境下,传统摄影机更能为每个靶标提供更高的分辨率。参见使用多谱段相机和传统相机所拍的宽场图像的比较。 
多谱段与传统技术

PD-L1、CD3ε、CD8α Multiplex IHC Panel #65713:使用 PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684(绿色)、CD3ε (D7A6E) XP® Rabbit mAb #85061(黄色)和 CD8α (C8/144B) Mouse mAb (IHC Specific) #70306(红色),对石蜡包埋的人乳腺癌细胞进行三重荧光 mIHC 分析。蓝色伪彩 = DAPI #8961(DNA 荧光染料)。

  • 较大的小图尺寸(> 4 靶标/荧光基团)则需使用多谱段相机。多谱段显影系统支持能够线性分离具有重叠激发/发射光谱的荧光基团(和色素原)的软件,因此能够以较高的分辨率促进多重靶标检测。在进行共表达分析时,这一点尤为关键。

:组织自发荧光是一个通常会导致荧光 IHC 敏感性较低的问题。在所有荧光显影平台环境下,这种现象较为明显。多谱段分析软件可以解决这个问题,它能消减源于未染色组织的人造荧光信号。

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