CUT&Tag 概述

与 CUT&RUN 一样，靶向切割及标签技术 (CUT&Tag) 是一种比 ChIP-seq 更快、更经济的替代方法。与 ChIP-seq 相比，用 CUT&Tag 进行染色质分析所需样品更少、工作流程更简化、测序成本更低，并且由于背景更低，信噪比也得到了改善。CUT&Tag 比 CUT&RUN 更快，因为大部分文库制备过程在体内进行，提供等同于 CUT&RUN 的数据并令单细胞 CUT&Tag 成为可能。

Cell Signaling Technology^® CUT&Tag 试剂和试剂盒与其他产品一样，经过严格验证，以确保性能。CST 还使用这些相同的试剂验证 CUT&Tag 抗体，从而每次确保性能和可靠性。

是什么让 CUT&Tag 与众不同

CUT&Tag 和 CUT&RUN 均可用于分析天然染色质，而 ChIP 和 ChIP-seq 传统上使用交联染色质。对于 CUT&Tag 和 CUT&RUN，细胞膜都被透化，所以一抗可以通过核孔进入胞核，并在其中与目的靶标结合。适当的 pAG 酶与抗体结合，并且激活后在抗体结合处任一侧切割 DNA。

CUT&RUN 和 CUT&Tag 都可以使用果蝇 spike-in 标准化对照。在实验开始时添加果蝇 spike-in 细胞核；随后在一抗孵育步骤中添加相应的 H2Av 抗体。

使用果蝇 Spike-in 对照的实验工作流程

CUT&Tag 工作流程（左侧）交付稳健的蛋白质-DNA 相互作用数据，同时减少 DNA 文库制备时间。

CUT&Tag 与 CUT&RUN 有何不同？

• CUT&Tag 在一抗孵育步骤之后利用二抗孵育步骤增强信号强度。
• CUT&Tag 在高盐条件下进行。两种方法均与组蛋白分析兼容。然而，CUT&Tag 不太兼容于转录因子和辅因子，因为高盐条件可能干扰靶标蛋白质-DNA 相互作用。对于丰度较低或弱结合的靶标尤其如此。
• CUT&RUN 使用 Ca2⁺ 激活的 pAG-MNase 切割 DNA，而 CUT&Tag 使用 Mg2+ 激活的 pAG-Tn5 切割 DNA。Tn5 带有 Illumina 接头，这些接头在切割过程中添加到染色质中。
• CUT&Tag 在标签化后使胞膜和核膜均透化，以完全溶解 CUT&Tag DNA。这导致最终 DNA 样品中同时存在标签化 DNA 和基因组 DNA，使得 CUT&Tag DNA 不兼容 qPCR 。如果需要 qPCR，我们建议进行 CUT&RUN。
• CUT&Tag 跳过了 CUT&RUN 所需的体外接头连接步骤，使您能够直接进入 PCR 扩增 DNA 文库用于测序，从而节省宝贵的时间。
• CUT&Tag 节省的时间是累积的，这意味着随着样本数量的增加，您会节省更多时间。

CUT&Tag 提供：

现在 CUT&Tag 可以使用全流程 Spike-In 标准化对照

CST 提供两款与 CUT&Tag Assay Kit #77552 兼容的 CUT&Tag 果蝇 Spike-In 对照试剂盒：

果蝇 Spike-in 标准化可提高药物响应数据的可信度<br/>

在标准化数据中，接受他泽司他处理的样品显示 H3K27me3 和 Ezh2 信号降低，与 EZH2 抑制一致，而 H3K4me3 和 H3K27ac 信号仍保持相当。这展示了果蝇 spike-in 标准化策略如何提高可信度，即确保所观察到的全局组蛋白标记变化代表真实的生物学响应，而不是技术变异。

Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit)

使用 CUT&Tag Assay Kit #77552 和 Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit)，以 100,000 个用或未用 1 μM 他泽司他处理 6 天的 MCF7 细胞（如所示）以及 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit Monoclonal Antibody #9733、Ezh2 (D2C9) Rabbit Monoclonal Antibody #5246、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 或 Acetyl-Histone H3 (Lys27) (D5E4) Rabbit Monoclonal Antibody #8173 进行 CUT&Tag 实验。使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。本图显示了 HOXA 基因簇上的结合情况。标准化后，EZH2 抑制剂处理后的 H3K27me3 和 EZH2 信号均显著降低，这与 H3K27me3 水平降低一致。相比之下，H3K4me3 和 H3K27Ac 信号仍然保持相当，或略有增加，因为该药物不会直接影响这些标记。另一方面，H3K27me3 占据的减少可能使同一基因座上 H3K4me3 或 H3K27Ac 的结合增加。

在标准化数据中，接受他泽司他处理的样品显示 H3K27me3 信号降低，与 EZH2 抑制一致，而 H3K4me3 信号仍保持相当。这展示了果蝇 spike-in 标准化策略如何提高可信度，即确保所观察到的全局组蛋白标记变化代表真实的生物学响应，而不是技术变异。

Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse)

使用 CUT&Tag Assay Kit #77552 和 Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse)，以 100,000 个用或未用 1 μM 他泽司他处理 6 天的 MCF7 细胞（如所示）和小鼠 H3K27me3 抗体或小鼠 H3K4me3 抗体进行 CUT&Tag 实验。使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示了 HOXD 基因簇和 ACTB 基因上的结合情况，二者分别是 H3K27me3 和 H3K4me3 的已知靶标。标准化后，EZH2 抑制剂处理后的 H3K27me3 信号显著降低，这与 H3K27me3 水平降低一致。相比之下，H3K4me3 信号仍然保持相当，因为该药物不影响 H3K4me3。

使用果蝇 Spike-In 对照实现各细胞滴定间的准确信号标准化

果蝇 spike-in 标准化可确保 CUT&Tag 信号强度随起始细胞量适当缩放。在下面的细胞滴定实验中，标准化数据显示 MYC 基因上的信号强度与起始细胞量呈强正相关，表明成功校正了样品输入的变异性。

Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit)

使用 CUT&Tag Assay Kit #77552 和 Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit)，以 200,000、100,000、50,000 或 25,000 个 Hela 细胞（如所示）和 CTCF (D1A7) Rabbit Monoclonal Antibody #3417 进行 CUT&Tag 实验。使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示了 CTCF 的已知靶标基因 MYC 内的结合。标准化后，信号强度与起始细胞量呈正相关。

标准化数据显示 GAPDH 基因上的信号强度与起始细胞量呈强正相关，表明成功校正了样品输入变异性。

Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse)

使用 CUT&Tag Assay Kit #77552 和 Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse)，以 100,000、50,000 或 25,000 个 Hela 细胞（如所示）和小鼠 H3K4me3 抗体进行 CUT&Tag 实验。使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。结果图显示在 GAPDH 内结合，GAPDH 是 H3K4me3 的一种已知靶基因。标准化后，信号强度与起始细胞量呈正相关。

何时使用 CUT&Tag 与 CUT&RUN

当您时间和/或样品不足时，CUT&Tag 和 CUT&RUN 都可以帮助您分析蛋白质-DNA 相互作用。

请参照下表，选择适合您需求的方法。

CUT&Tag 兼容下一代测序分析 (NGS) ，并且样品和时间有限时，CUT&Tag 是理想的研究组蛋白修饰如何调节染色质结合的方法。当您或 CST 等商业供应商专门针对 CUT&Tag 验证所使用的抗体时，它还可用于研究转录因子。

订购 CST^® CUT&Tag Assay Kit #77552 以及相应的果蝇 Spike-In 对照试剂盒以获得您进行 CUT&Tag 实验所需的所有试剂，也可仅购买您需要的试剂。所有 CUT&Tag 试剂都严格经内部验证，以确保您每次都会获得高质量试剂。您还可以从不断扩大的经 CST CUT&Tag 验证的抗体列表中选择。

可比较的数据，更快获得结果

CUT&Tag 试剂以一半的文库制备时间，为您提供与 CUT&RUN 所能得到的相同高质量数据。

用 CUT&Tag 分析组蛋白修饰

在研究组蛋白修饰如三甲基组蛋白 H3 (Lys4) 或三甲基组蛋白 H3 (Lys27) 时，用 CUT&Tag Assay Kit #77552、CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 或按需订购的产品得到跟 ChIP-seq 和 CUT&RUN 等同的数据。使用 100,000 个起始细胞在 1-2 天内从细胞转化为文库 DNA。

H3K4me3

分别使用 SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 和 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示在染色体 12 上的结合情况（上图），包括 H3K4me3 的已知靶标基因 GAPDH（下图）。

H3K27me3

使用 SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 和 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 NCCIT 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit Monoclonal Antibody #9733 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示 H3K27me3 在染色体 10 上的富集（上图），包括 PAX2 基因（下图）。

用 CUT&Tag 分析转录因子和辅因子

在研究转录因子或辅因子如 Nanog、雌激素受体 α 和 JARID2 时，用 CUT&Tag Assay Kit #77552、CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 及经 CUT&Tag 验证的抗体生成跟 ChIP-seq 和 CUT&RUN 等同的数据。使用 100,000 个起始细胞在 1-2 天内从细胞转化为文库 DNA。

Nanog

分别使用 SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 和 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 F9 细胞和 Nanog (D2A3) Rabbit Monoclonal Antibody (Mouse Specific) #8822 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示结合作用遍及 X 染色体（上图），包括 Nanog 的已知靶标基因 Xist（下图）。

雌激素受体 α

分别使用 SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 和 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 MCF7 细胞（在无酚红培养基和 5% 活性炭吸附的胎牛血清 [FBS] 中生长 4 天，然后用 β-雌二醇 [10 nM] 处理 45 分钟）和 Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit Monoclonal Antibody #8644 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示在染色体 21 上的结合情况（上图），包括雌激素受体 α 的已知靶标基因 TFF1（下图）。

JARID2

使用 CUT&Tag Assay Kit #77552、CUT&RUN Assay Kit #86652 或 SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，以 NCCIT 细胞和 JARID2 (D6M9X) Rabbit Monoclonal Antibody #13594 进行 CUT&Tag、CUT&RUN 和 ChIP-seq 实验。对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库；对于 ChIP-seq 和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。上图比较了 HOXA 基因周围的富集情况，下图比较了 HOXD 基因周围的富集情况，两个基因都是 JARID2 的已知靶标基因。

用 CUT&Tag 分析组织样品

您还可以使用 CUT&Tag 分析组织样品中的组蛋白标记。如果您正在分析组织中的转录因子或辅因子，我们建议您使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。

脑组织

使用 SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 或 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 25 mg（用于 ChIP-seq）或 1 mg（用于 CUT&RUN 和 CUT&Tag）小鼠新鲜脑组织和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示 H3K4me3 在染色体 6 上的富集（上图），包括 H3K4me3 的已知靶标基因 Gapdh（下图）。

肝组织

使用 SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 或 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 25 mg（用于 ChIP-seq）或 1 mg（用于 CUT&RUN 和 CUT&Tag）小鼠新鲜肝组织和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示 H3K4me3 在染色体 6 上的富集（上图），包括 H3K4me3 的已知靶标基因 Gapdh（下图）。

心脏组织

使用 SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 或 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 25 mg（用于 ChIP-seq）或 1 mg（用于 CUT&RUN 和 CUT&Tag）小鼠新鲜心脏组织和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示 H3K4me3 在染色体 6 上的富集（上图），包括 H3K4me3 的已知靶标基因 Gapdh（下图）。

即使 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统信号低时仍能成功测序

纯化的 CUT&Tag DNA 可以使用如 Thermo Fisher Scientific NanoDrop 或 Qubit 荧光定量系统等平台定量，然后在 NGS 之前用如 Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation 系统等平台进行 QC。应注意，DNA 文库计算产率可能随所用定量方法有所不同。

即使您在 Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation 系统谱图中看到非常弱的峰或没有可见峰，无论使用何种 CUT&Tag 试剂，您仍然可以成功对 DNA 文库测序，因为 CUT&Tag 基线低于 ChIP-seq 和 CUT&RUN。因此，我们建议继续测序，因为即使 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统信号低，仍然可能获得具有高基因组信号的测序数据。

低产率文库的关键提示：

• 使用正确的工具：为了进行最准确的评估，我们建议使用 High Sensitivity ScreenTape Assay，而不是 Standard 版本。其优化后的化学体系能更好地捕获 CUT&Tag 文库的微弱信号。
• 组蛋白修饰与转录因子：组蛋白修饰通常呈现清晰信号，而转录因子或辅因子的文库往往显示非常弱的峰，甚至没有可见峰。
• 相信实验流程：即使信号微弱，这些文库仍常能产出高质量的 NGS 结果，具有高比对率和清晰的结合峰。
• 混样策略：如果 Bioanalyzer 或 TapeStation 无法确定您的平均文库大小，我们建议按 900 bp 的估算大小进行操作。您可以有意稍微提高低产率文库的混样比例，以确保获得良好的测序结果。

如需更深入地了解如何处理低产率问题，请阅读博客：CUT&Tag DNA 文库产量：如果水平值太低而无法检测该怎么办。

三种不同 CUT&Tag 文库的 Bioanalyzer 系统谱图

使用多个来源的负载 pAG-Tn5，以 HCT 116 细胞和 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit Monoclonal Antibody #2569 进行 CUT&Tag 实验。每种酶的用量基于制造商的建议。使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示了 CUT&Tag 文库 DNA 的 Bioanalyzer 系统谱图。对相同的 DNA 文库测序，它们的 NGS 迹线见下图。

三种不同 CUT&Tag 文库的 NGS 轨迹图

所示为对用 Bioanalyzer 系统分析的 DNA 文库进行测序后的 NGS 轨迹图。NGS 数据显示在染色体 8 上的等效结合情况（上图），包括 TCF4 的已知靶标基因 MYC（下图）。

或者，您可以通过使用针对 DNA 文库上已知阳性因座和阴性基因座的引物，借助 qPCR 对您的 CUT&Tag DNA 文库进行 QC，以确定 NGS 之前染色质片段的富集情况。

CUT&Tag 产品选项

CST CUT&Tag 试剂盒和自选试剂由我们实验室科学家和主题专家组成的表观遗传学应用团队做了内部验证，以确保试剂在到达您的实验室时发挥作用。在下面找到用于您工作流程的正确解决方案。

参考文献

1. Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 2019;10(1):1930. Published 2019 Apr 29. doi:10.1038/s41467-019-09982-5
2. Egan, B. et al. An Alternative Approach to ChIP-Seq Normalization Enables Detection of Genome-Wide Changes in Histone H3 Lysine 27 Trimethylation upon EZH2 Inhibition. (2016) PLoS ONE 11, e0166438
3. Taruttis, F. et al. External calibration with Drosophila whole-cell spike-ins delivers absolute mRNA fold changes from human RNA-Seq and qPCR data. (2017) Biotechniques 62, 53-61 Pubmed 28193148

_{美国专利第 11,733,248 号、外国等效专利及从中衍生的子专利。}

_{本产品根据 Active Motif 拥有的某些专利进行供应和销售，涉及美国专利号 9938524、10689643、11306307 和 12049622，以及其他国家/地区的相关专利。仅供购买者内部研究使用。不得用于转售、服务或其他商业用途。}

_{第7,429,487号美国专利，外国对应物，以及由此而来的儿童专利。}

_{Cell Signaling Technology 和 SimpleChIP 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。}

_{所有其他商标均为各自所有者专有。访问 cellsignal.com/legal/trademark-information 以了解更多信息。}