Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate) #8050

用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法，进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液和试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808)。

2. 10X 细胞裂解缓冲液： (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1% Triton X-100，2.5 mM 焦磷酸钠，1 mM β 甘油磷酸酯，1 mM Na₃VO₄，1 μg/ml 亮抑酶肽

   注意： CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

3. 3X SDS 样品缓冲液： (#7722) 187.5 mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C），6% w/v SDS，30% 甘油，150 mM DTT，0.03% w/v 溴酚蓝
4. 6-Tube Magnetic Separation Rack：(#7017)。
5. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH₂O 中并混合。
6. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎，每次 5秒。
6. 在 4°C，14,000 x g 条件下，离心 10 分钟，将上清转移到新管中。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

1. 取 200 μl 细胞裂解物并添加 10 µl 固定化抗体，在 4°C 转动孵育过夜。
2. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀，待完全澄清后，废弃上清液，添加 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液，涡旋混合以重悬及洗涤微珠，继续重复 4 次，共计洗涤 5 次。
3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
3. 对于 SDS-PAGE，将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）作为二抗，以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

1. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀，待完全澄清后，废弃上清液，添加 500 µl 1X 激酶缓冲液，涡旋混合以重悬及洗涤微珠，继续重复 1 次，共计洗涤 2 次。洗涤间期，保持样品于冰上。
2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。