查看特别推荐 >>
8050
Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate)
WB 试剂与 IP 试剂
单克隆抗体
R
重组

Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate) #8050

引用 (3)
筛选器:
  1. IP
Immunoprecipitation Image 1: Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate)
使用 Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate)(泳道 1 和 2)和 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Magnetic Bead Conjugate) #8726(泳道 3 和 4),对未经处理或已经 Calyculin A 处理的 Jurkat 细胞裂解物进行免疫沉淀。使用 Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (HRP Conjugate) #6950 检测蛋白质印迹。
To Purchase # 8050S
目录# 规格 价格 库存
8050S
400 µl

支持性数据

反应性 All
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体通过甲酰苯甲酰胺修饰抗体与酰肼激活磁珠之间的共价反应进行固定。
Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate) 可用于对磷酸化 Akt 底物蛋白进行免疫沉淀。

产品使用信息

应用 稀释度
免疫沉淀法 1:20

保存

保存在 PBS 缓冲液(pH 为 7.2),0.1% Tween® 20 中。4°C 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

打印

查看 > 收起 >

用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法,进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液与试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808)。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5),150 mM NaCl,1 mM EDTA,1 mM EGTA,1% Triton X-100,2.5 mM 焦磷酸钠,1 mM β 甘油磷酸酯,1 mM Na3VO4,1 μg/ml 亮抑酶肽

    注意: CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

  1. 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 6.8,25°C),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝
  2. 6-Tube Magnetic Separation Rack:(#7017)。
  3. 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  4. ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎,每次 5秒。
  6. 在 4°C,14,000 x g 条件下,离心 10 分钟,将上清转移到新管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 取 200 μl 细胞裂解物并添加 10 µl 固定化抗体,在 4°C 转动孵育过夜
  2. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀,待完全澄清后,废弃上清液,添加 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液,涡旋混合以重悬及洗涤微珠,继续重复 4 次,共计洗涤 5 次。
  3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)作为二抗,以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

  1. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀,待完全澄清后,废弃上清液,添加 500 µl 1X 激酶缓冲液,涡旋混合以重悬及洗涤微珠,继续重复 1 次,共计洗涤 2 次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​时间 2007 年 12 月

修订时间 2021 年 10 月

实验步骤编号:408

特异性/灵敏度

Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate) 可识别包含磷酸化 Ser/Thr(其前方的 3 位点有 Arg)的肽和蛋白。观察到它可在某种程度上优先检测包含磷酸化 Ser/Thr(在其前方的位点 -5 和 -3 有 Arg)的肽。(美国专利编号:6,441,140;6,982,318;7,259,022;7,344,714;美国标准编号 11,484,485;以及所有外国对等物。)

物种反应性:

预期的所有物种

来源/纯化

使用磷酸-Akt 底物合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

作为激酶的一个重要类别,Arg 引导型激酶或 AGC 家族激酶,包括 cAMP-依赖性蛋白激酶 (PKA)、cGMP-依赖性蛋白激酶 (PKG)、蛋白激酶 C、Akt 和 RSK。这些激酶具有相同的底物特异性,其特征为相对于磷酸化的 Ser 或 Thr 位点,具有在位置 -3 处 的 Arg (1,2)。Akt 在介导关键细胞反应(包括细胞生长与存活、血管生成和转录调节)中发挥核心作用 (3-5)。尽管已经知道多种 Akt 底物(如 GSK-3、Bad 和胱天蛋白酶-9)但是许多重要的底物仍等待发现。Akt 仅在以位置 -5 和 -3处 Arg 为特征的保守基序中在 Ser/Thr 位点磷酸化底物 (6)。Cell Signaling Technology 的磷酰-Akt 底物特异性抗体是研究 Akt 和其他 Arg 引导型激酶调节磷酸化以及高通量激酶药物研发的强有力工具。

限制使用

除非 CST 的合法授书代表以书面形式书行明确同意,否书以下条款适用于 CST、其关书方或分书商提供的书品。 任何书充本条款或与本条款不同的客书条款和条件,除非书 CST 的合法授书代表以书面形式书独接受, 否书均被拒书,并且无效。

专品专有“专供研究使用”的专专或专似的专专声明, 且未专得美国食品和专品管理局或其他外国或国内专管机专专专任何用途的批准、准专或专可。客专不得将任何专品用于任何专断或治专目的, 或以任何不符合专专声明的方式使用专品。CST 专售或专可的专品提供专作专最专用专的客专,且专用于研专用途。将专品用于专断、专防或治专目的, 或专专售(专独或作专专成)或其他商专目的而专专专品,均需要 CST 的专独专可。客专:(a) 不得专独或与其他材料专合向任何第三方出售、专可、 出借、捐专或以其他方式专专或提供任何专品,或使用专品制造任何商专专品,(b) 不得复制、修改、逆向工程、反专专、 反专专专品或以其他方式专专专专专品的基专专专或技专,或使用专品开专任何与 CST 的专品或服专专争的专品或服专, (c) 不得更改或专除专品上的任何商专、商品名称、徽专、专利或版专声明或专专,(d) 只能根据 CST 的专品专售条款和任何适用文档使用专品, (e) 专遵守客专与专品一起使用的任何第三方专品或服专的任何专可、服专条款或专似专专

仅供研究使用。不得用于诊断程序。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
所有其他商标均属各自所有者专有。访问我们的商标信息页面。
Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink